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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
專(zhuān)家顧問(wèn) (知名作家)
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專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn): +218 - BioEPI: 11
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
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【答案】應(yīng)助回帖
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大魚(yú)大魚(yú): 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2014-08-21 21:42:18
大魚(yú)大魚(yú): 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2014-08-21 21:42:18
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生物信息學(xué)參考書(shū)： 1.DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具(第二版)PDF http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6358121&fpage=1&target=blank 下載后即可閱讀。 2.DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具_(dá)(第三版） http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7614763&fpage=1&target=blank 下載后好像無(wú)法解壓，樓主試試看吧，至少“DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具(第二版)”肯定能夠用。 “DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具(第二版)”都是講的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)軟件的具體應(yīng)用，很容易看懂并且自己上手操作，不過(guò)沒(méi)有講述各種算法的原理。 如果要更深入學(xué)習(xí)生物信息學(xué)，建議學(xué)習(xí)： 1.Pierre Baldi etal.,Bioinformatics------the Machine Learning Approach,MIT press,2001,千萬(wàn)不要看該書(shū)的翻譯版本，翻譯版爛的難以想象，翻譯版就連條件概率的公式的含義都不知道怎么解釋?zhuān)?br /> 2. 2.M.Zvelebil ,J.O.Baum 著（2008），李亦學(xué)、郝沛 主譯，理解生物信息學(xué)，科學(xué)出版社，2012，這本書(shū)的英文原版，我還沒(méi)有見(jiàn)過(guò)，此書(shū)內(nèi)容豐富，解析詳細(xì)，但是讓人非常不爽的是全書(shū)所有的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件下載處均未在正文中給出具體網(wǎng)址，而是每章末的參考文獻(xiàn)中給出帶有具體網(wǎng)址的SCI文獻(xiàn)。 3.李霞、李亦學(xué) 主編，生物信息學(xué)學(xué)習(xí)指導(dǎo)與習(xí)題集，人民衛(wèi)生出版社，2011，現(xiàn)在大陸唯一的一本生物信息學(xué)習(xí)題解答，包括上機(jī)題目中不少也有文字版本的具體解答。 4.M.Michael Gromiha,Protein Bioinformatics:From Sequence to Function,Elsevier,2001. 其他的參考文獻(xiàn)請(qǐng)自行搜索。 |
3樓2014-08-20 11:51:05
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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我建議樓主在設(shè)計(jì)分離提純目的蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程時(shí)，先把目的蛋白質(zhì)自身的理化性質(zhì)弄清楚，然后根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)來(lái)分離提純蛋白質(zhì)，分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)的方法，至少蛋白質(zhì)的pI和相對(duì)分子量應(yīng)該知道吧，不然有什么依據(jù)來(lái)作分離提純哪？ 下文分為三個(gè)部分： 一、蛋白質(zhì)分離提純前的準(zhǔn)備工作（包括生物信息學(xué)工作和基因表達(dá)工作） 1.確定蛋白質(zhì)的具體來(lái)源。 （1）確定要分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞來(lái)源和組織來(lái)源。先培養(yǎng)細(xì)胞和分離細(xì)胞和組織成分。分離細(xì)胞用流式細(xì)胞儀很容易，尤其是把腫瘤細(xì)胞從非腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的群體中中分離出來(lái)，參考： MMB 263-Flow Cytometry Protocols 2E（with contents） http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7637366 。 （2）確定目的蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。不知道亞細(xì)胞定位，可以從數(shù)據(jù)庫(kù)自己查一下，或者用生物分子功能的預(yù)測(cè)軟件加以預(yù)測(cè)。 參考：D. J. Rigden Edits, From Protein Structure to Function with Bioinformatics(2009) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6382178 如果是真核細(xì)胞，則一般應(yīng)該確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的哪個(gè)細(xì)胞器或者細(xì)胞空間富集，然后在粗分離時(shí)現(xiàn)在粉碎細(xì)胞后，分離相關(guān)的細(xì)胞器（細(xì)胞裂解液中留下需要的有型的各種細(xì)胞器），或者細(xì)胞介質(zhì)（細(xì)胞裂解液中去掉有型的各種細(xì)胞器），一般粉碎細(xì)胞后可以用離心的方法加以實(shí)現(xiàn)。 2.確定蛋白質(zhì)的pI。首先要使用生物信息學(xué)方法，比如用DNAStar中的Protean，打開(kāi)或者重建一個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列文件，然后選擇analysis----->Titration Curve，分析其滴定曲線(xiàn)與等電點(diǎn)，顯示出的曲線(xiàn)圖為：橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)的凈電荷數(shù)，縱坐標(biāo)為pH，會(huì)自動(dòng)標(biāo)出pI值。 3.確定目的蛋白質(zhì)的親水性和疏水性的大概的氨基酸殘基的分布區(qū)域（這個(gè)操作不是必須的）。目的蛋白質(zhì)的親水性和疏水性的大概的氨基酸殘基的分布區(qū)域預(yù)測(cè)，即預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的序列中的可能存在的典型的親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域的氨基酸殘基，有助于分析蛋白質(zhì)序列的抗原表位�？梢杂肂ioEdit，啟動(dòng)BioEdit，選擇File--->Open，再點(diǎn)擊New Alignment,再選擇Sequence ---->New Sequence，在窗口出現(xiàn)的地方選擇序列的類(lèi)型為protein，然后貼上蛋白質(zhì)序列，然后掃一下序列，選擇Sequence------>Protein ---->Kyte & Doolittle Mean Hydrophobicity Profile，在出現(xiàn)的窗口中點(diǎn)擊Run Plot,會(huì)得到橫坐標(biāo)為氨基酸位點(diǎn)，總坐標(biāo)為 Mean Hydrophobicity Profile 的坐標(biāo)曲線(xiàn)圖。另外，利用DNAstar的Protean也可以得到Hydrophobicity Profile，打開(kāi)或者重建一個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列文件，選擇analysis----->Show Available Methods，顯示出More Methods，其中有Hydropathy-Kyte-Doolittle，其下面有：Hydrophobicity Plot，Hydrophobic Regions，Hydrophilicity Plot，Hydrophilic Regions 四種分類(lèi)和相應(yīng)的圖標(biāo)，根據(jù)操作界面的提示展開(kāi)Hydropathy后會(huì)得到一個(gè)Hydrophobicity Plot，Hydrophobic Regions，Hydrophilicity Plot，Hydrophilic Regions 四種分類(lèi)和相應(yīng)的圖標(biāo)構(gòu)成直線(xiàn)圖，上面會(huì)顯示出各個(gè)氨基酸的疏水和親水性。 4.確定目的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。最簡(jiǎn)單的方法用質(zhì)譜直接測(cè)定目的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。如果根本沒(méi)有目的蛋白質(zhì)，那么就用110X目的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基總數(shù)。也可以用110X目的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基總數(shù)后，再用SDS PAGE總可以測(cè)定出來(lái)目的蛋白質(zhì)的較為精確的分子量，如果幾條帶比較接近，分別回收后測(cè)序即可確定哪一條帶是目的蛋白質(zhì)，實(shí)際上一般只需要對(duì)N末端測(cè)定大概15個(gè)左右的氨基酸殘基就能確定了，當(dāng)然，這步的前提是要大致提取出來(lái)目的蛋白質(zhì)。用軟件可以精確地計(jì)算出蛋白質(zhì)的分子量，可以用ANTHEPROT，啟動(dòng)后進(jìn)入antheprot Editor 窗口，把待測(cè)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列文件拷貝進(jìn)去即可，菜單上有很多的選項(xiàng)，根據(jù)需要，點(diǎn)擊按鍵，比如Methods ,選擇分子量，滴定曲線(xiàn)等，會(huì)得到相對(duì)分子量，PI等信息。這一步是必須的。 5.預(yù)測(cè)目的蛋白質(zhì)的可能的空間三維形態(tài)。直接預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)即可，這步對(duì)于分離提純這一步不是必須的。 6.預(yù)測(cè)目的蛋白質(zhì)的可能的相互作用的蛋白質(zhì)。這一步也不是必須的，因?yàn)槟憧梢灾苯又苽鋯慰寺】贵w。 7.如果上游的基因表達(dá)部分的蛋白質(zhì)的表達(dá)量是在太小，首先是要加大目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量，不然下游再如何努力也沒(méi)有用。如果樓主一點(diǎn)要在很低濃度的目的蛋白質(zhì)環(huán)境中提取和富集目的蛋白質(zhì)，那么最好的一種方法是Protein equaliser technology，一種組合化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，原理上也親和層析差不多，當(dāng)然效率要高的多。 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的可能的空間三維形態(tài)和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的可能的相互作用的蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)方法請(qǐng)見(jiàn)： 確定蛋白質(zhì)—多肽相互作用結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：凌波麗個(gè)人總結(jié)之二 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957&fpage=1&target=blank 上面附有參考文獻(xiàn)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)網(wǎng)站。 8.如果根本就沒(méi)有辦法獲得目的蛋白質(zhì)，而且這樣的蛋白質(zhì)還是全新的，也就是根本分離不到目的蛋白質(zhì)，就別想拿到抗原，連WB也做不成，更別說(shuō)親合層析。那么怎么辦？ 一種方法通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的可能的相互作用的蛋白質(zhì)，找出其受體或者與其有親和性的蛋白質(zhì)，作為親和層析的配體，這就是有�。∵�可以通過(guò)表位的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，查找與其表位類(lèi)似的其他蛋白質(zhì)，用后者制備出多克隆抗原，作為親合介質(zhì)，然后對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行親和層析，這就是更加有��！最簡(jiǎn)單的辦法沒(méi)有親和片段，自己接上去一段就是，就用His6標(biāo)簽，而且His6標(biāo)簽得基因與目的蛋白質(zhì)的基因之間構(gòu)建凝血酶位點(diǎn)，因?yàn)楸阌诤笃谇谐龢?biāo)簽，用鎳柱親和層析，這在什么情況下都可以用。 二、蛋白質(zhì)的分離提純的一般順序（這部分借鑒了我的一位朋友的工作筆記，并得到其許可使用和進(jìn)行編輯修改）。 蛋白質(zhì)的分離提純由于不同的蛋白質(zhì)的彼此差異較大，就普遍而言可能沒(méi)有特定的分離純化的固定順序，不過(guò)仍然有一些可以參考的大致的分離純化流程。因?yàn)槲业膶?shí)驗(yàn)工作是與重組蛋白質(zhì)相關(guān)，所以就在這里討論重組蛋白分離純化的可作參考的大致的分離純化流程。一般來(lái)說(shuō)，重組蛋白質(zhì)的分離純化比天然蛋白質(zhì)要容易一些。 一般蛋白質(zhì)的分離純化的一般順序是：粉碎細(xì)胞或提取含有提取分泌到細(xì)胞外的表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)基、沉淀、過(guò)濾、初步濃縮（比如超濾）、中間純化操作、最后采用高分辨率的純化方法進(jìn)行分離純化、產(chǎn)物鑒定和保存。 第一步，粗分離。粉碎細(xì)胞或提取含有提取分泌到細(xì)胞外的表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)基、沉淀、過(guò)濾、初步濃縮（比如超濾）一般也叫粗分離。與天然蛋白質(zhì)的分離純化相比，重組蛋白質(zhì)的分離純化可以不用先去確定足量表達(dá)目的蛋白質(zhì)的組織與細(xì)胞，并且先對(duì)這些組織和細(xì)胞進(jìn)行分離和富集，另外由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的廣泛使用，重組蛋白質(zhì)往往在大腸桿菌細(xì)胞中形成包涵體，如果不用分泌表達(dá)的話(huà)，這樣粉碎了大腸桿菌細(xì)胞后只要過(guò)濾就可以獲得固體的包涵體顆粒。即使要使用酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白也往往需要先在大腸桿菌細(xì)胞等原核細(xì)胞中進(jìn)行試表達(dá)。 如果不形成包涵體時(shí)，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀可使用、丙酮、硫酸銨、聚乙烯亞酰胺等化學(xué)試劑或者調(diào)節(jié)溶液的pH值至目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)獲得沉淀并經(jīng)過(guò)過(guò)濾而取出，然后在對(duì)沉淀物進(jìn)行溶解，如果是耐高溫的目的蛋白質(zhì)可以通過(guò)加熱使得其他蛋白質(zhì)變性后沉淀，然后提取和保留上清液，上清液里即含有目的蛋白質(zhì)。聚乙二醇對(duì)于濃縮非包涵體蛋白質(zhì)是一種有效的試驗(yàn)方法，而且聚乙二醇很少使得蛋白質(zhì)變性，真的變性了之后加入水溶解濃縮的蛋白質(zhì)樣品液，然后用適當(dāng)孔徑的超濾離心管除去聚乙二醇即可。 包涵體經(jīng)過(guò)離心、沉淀、過(guò)濾獲得后，也必須使得包涵體溶解，否則后面的分離提純工作就無(wú)法進(jìn)行了。 不易溶解于水的蛋白質(zhì)可使用去垢劑或表面活性劑增溶 以便達(dá)到蛋白質(zhì)溶解于水的目的，但是不要使用超聲波把渾濁的蛋白質(zhì)溶液“絞”成清亮狀態(tài)，因?yàn)槌暡ǖ哪芰孔阋源驍喙矁r(jià)鍵，使得肽鏈斷裂。不幸的是：一些實(shí)驗(yàn)操作者對(duì)于超聲波發(fā)生器似乎有過(guò)于強(qiáng)烈的實(shí)驗(yàn)需求，可能是因?yàn)椴僮魇∈�，反正�?qiáng)度適當(dāng)且時(shí)間足夠，開(kāi)動(dòng)超聲波發(fā)生器肯定是能把渾濁的蛋白質(zhì)溶液“絞”成清亮狀態(tài)，超聲波連帶有肽聚糖細(xì)胞壁的大腸桿菌細(xì)胞都能粉碎，何況溶液中的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)而言之，利用蛋白質(zhì)的溶解度和抗熱性與抗蛋白酶解等特殊性質(zhì)分離出蛋白質(zhì)一般是在第一步的粗分離階段，而不在中間純化和精細(xì)分離這兩個(gè)步驟進(jìn)行，粗分離過(guò)程也利用蛋白質(zhì)的密度、分子量大小和形狀的特性，蛋白質(zhì)的后三種性質(zhì)在后面的中間純化和精細(xì)分離同樣會(huì)利用到。利用蛋白質(zhì)的溶解度與抗蛋白酶解等特殊性質(zhì)有時(shí)候在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的質(zhì)量檢測(cè)階段也可能用到。粗分離階段已經(jīng)能夠去掉相當(dāng)多的DNA、多糖、脂類(lèi)、熱源、病毒等非蛋白質(zhì)的雜質(zhì)成分，但是以后的分離純化蛋白質(zhì)的技術(shù)環(huán)節(jié)仍然必須考慮到去除非蛋白質(zhì)的雜質(zhì)成分。 第二步，中間純化。中間純化階段一般是利用蛋白質(zhì)的分子量、形狀、電荷性質(zhì)、等電點(diǎn)、疏水性、密度、與配體的結(jié)合能力、與金屬的結(jié)合能力、與有機(jī)小分子（比如某些、染料分子）的結(jié)合能力等特性進(jìn)行蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離提純。中間純化的實(shí)驗(yàn)操作普遍地包括各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、金屬螯合層析、等電點(diǎn)聚焦、凝膠過(guò)濾層析等，也包括離心、透析、超濾等其他操作穿插其間，不過(guò)一般沒(méi)有電泳，特別是在大規(guī)模分離提純蛋白質(zhì)時(shí)。SDS PAGE電泳一般不能用于分離提純蛋白質(zhì)，只能用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，因?yàn)镾DS PAGE電泳時(shí)，樣品會(huì)100度水浴變性，而后加上足量的SDS，SDS變性蛋白質(zhì)可能在除去SDS后使得蛋白質(zhì)復(fù)性，但是熱變性的蛋白質(zhì)，在目前的條件下很難復(fù)性，除非后面是用質(zhì)譜或者串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，或者是進(jìn)行WB檢測(cè)，否則SDS PAGE電泳回收的目的蛋白質(zhì)已經(jīng)沒(méi)有什么用處了。 各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、等電點(diǎn)聚焦、凝膠過(guò)濾層析、金屬螯合層析等在中間分離純化階段沒(méi)有完全固定的順序，雖然一般處理比較大量的樣品時(shí)，離子交換層析、疏水層析一般先使用，但是有時(shí)在凝膠層析之后也可能會(huì)用到離子交換層析、疏水層析，比較普遍的情況而言，親和層析、金屬螯合層析不會(huì)首先在中間分離階段的初始時(shí)期及使用。至少在我的工作經(jīng)驗(yàn)，電泳從來(lái)沒(méi)有用于過(guò)中間分離階段，電泳是用于蛋白質(zhì)的純度檢驗(yàn)階段，當(dāng)然不是唯一檢測(cè)純度的手段。中間純化步驟比較多的是首先使用離子交換層析和疏水層析，而后根據(jù)具體情況，可使用等電點(diǎn)聚焦、凝膠過(guò)濾層析等其他的層析方法，離心、透析、超濾等其他操作根據(jù)需要而穿插其間。再往后可以用親和層析和金屬螯合層析，不要把親和層析和金屬螯合層析一開(kāi)始就在中間純化階段使用，因?yàn)闃悠啡芤褐械碾s質(zhì)太多，會(huì)干擾受體-配體的專(zhuān)一性結(jié)合。 第三步是精細(xì)分離純化。精細(xì)分離純化一般是用凝膠過(guò)濾層析和HPLC，這樣可以依靠蛋白質(zhì)的分子量的差別得到比較純的目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且能夠去鹽和有機(jī)小分子（尤其是在親和層析和金屬螯合層析階段積累的鹽或有機(jī)小分子），HPLC過(guò)早使用效果不好，雜質(zhì)過(guò)多可能會(huì)堵住柱內(nèi)的填充介質(zhì)。親和層析和金屬螯合層析一般而言，也不適合作為分離提純蛋白質(zhì)工作的最后一步（具體理由會(huì)面會(huì)討論）。這三步結(jié)束時(shí)，一般目的蛋白質(zhì)樣品的濃度會(huì)有所降低，而且會(huì)有非緩沖溶液的其他的洗脫液，所以有必要用透析、超濾去除小分子和適當(dāng)濃縮，以利用產(chǎn)物檢測(cè)和保存。 第四步，產(chǎn)物鑒定。一方面需要檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的純度。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的純度一般可以用SDS-PAGE、蛋白質(zhì)的溶解度是否均一、HPLC、質(zhì)譜、生物功能、肽譜分析等檢測(cè)技術(shù)。實(shí)際上用紅外傅里葉光譜、紫外光譜和圓二色光譜聯(lián)合檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度更容易，而且不會(huì)損失樣品，即用被檢測(cè)蛋白質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)品的有關(guān)光譜參數(shù)加以對(duì)比。另一方面要檢測(cè)目的蛋白質(zhì)中的熱源、DNA、病毒等非蛋白質(zhì)成分，特別是對(duì)于藥用和食用蛋白質(zhì)，可以用FTIR，MS，被檢測(cè)的非目的蛋白質(zhì)的雜質(zhì)的生物活性檢測(cè)等。第五步，產(chǎn)物保存。一般而言，如果不是冷敏性的蛋白質(zhì)可使用凍干機(jī)制備為蛋白質(zhì)干粉狀制劑，然后放入0-4攝氏度的冰箱可長(zhǎng)期保存，也可將蛋白質(zhì)放入Eppendorf管，加入適量甘油和緩沖溶液（調(diào)節(jié)好濃度）后封口并貼上標(biāo)簽，再放入零下70攝氏度冰箱保存。對(duì)于冷敏性的蛋白質(zhì)或者不知低溫下是否穩(wěn)定的蛋白質(zhì)不能使用低溫凍干處理，將蛋白質(zhì)放入Eppendorf管，加入適量甘油和緩沖溶液（調(diào)節(jié)好濃度）后封口貼上標(biāo)簽，再放入零下70攝氏度冰箱保存，并且要分批小包裝，避免反復(fù)凍融。（二、蛋白質(zhì)的分離提純的一般順序部分借鑒了我的一位朋友的工作筆記，并得到其許可使用和進(jìn)行編輯修改，再往下又是我自己寫(xiě)的了） 三、我對(duì)于樓主的目的蛋白質(zhì)的分離純化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的意見(jiàn) 樓主的目的蛋白質(zhì)只要存在于細(xì)胞中，粗分離階段粉碎細(xì)胞后，進(jìn)行蛋白質(zhì)的沉淀、超濾、離心處理后，然后只要知道了等電點(diǎn)，用離子交換層析或者疏水層析先處理以便縮小樣品體積，根據(jù)蛋白質(zhì)的親水和疏水狀況而定。之后，在知道相對(duì)分子量的情況下，用分子篩層析。再往后金屬螯合層析或者抗體-抗原親和層析，至此怎么著都能收獲到一些目的蛋白質(zhì)。最后還可以用HPLC，雖然HPLC不用于制備。樓主的蛋白質(zhì)既然是癌細(xì)胞的糖蛋白質(zhì)，那么再洗分離時(shí)可以使用凝集素親和層析。另外在粗分離時(shí)首先分離癌細(xì)胞的你需要的細(xì)胞器。 |
2樓2014-08-20 11:49:28
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4樓2014-08-21 21:41:44
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