夢(mèng)鎖深秋2005

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[求助] 枯草芽孢桿菌PCR擴(kuò)增不出來(lái)的問(wèn)題已有7人參與

本人新入手了一株枯草芽孢桿菌，想進(jìn)行基因敲除�？赏幢蹍s一直擴(kuò)增不出來(lái)。提的基因組甚至都跑了電泳，條帶都能看得見(jiàn)，引物也是根據(jù)NCBI上的序列設(shè)計(jì)的。PCR用的東西都沒(méi)有問(wèn)題，中間引物也換了好幾對(duì)了，也從其他實(shí)驗(yàn)室借過(guò)其他的枯草芽孢桿菌，但就是P不出來(lái)，這是怎么回事啊。

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1樓 2014-08-25 09:45:38

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huyan0817

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根據(jù)樓主提供的信息排除了模板有問(wèn)題的情況，那多半是引物的問(wèn)題，設(shè)計(jì)兼并引物試一下！祝好運(yùn)！

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2樓2014-08-25 13:26:26

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bio_sci

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引物有問(wèn)題的可能性最大

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3樓2014-08-25 14:26:34

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夢(mèng)鎖深秋2005

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3樓: Originally posted by bio_sci at 2014-08-25 14:26:34
引物有問(wèn)題的可能性最大

我之前做的酵母，一直都是這樣設(shè)計(jì)的引物，一直沒(méi)有問(wèn)題，引物換過(guò)好幾對(duì)，也讓之前做過(guò)枯草的人設(shè)計(jì)過(guò)，但就是不行

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4樓2014-08-25 15:46:01

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johnkm66

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P不出來(lái)具體是什么情況？完全沒(méi)有條帶還是有但很淡？PCR不出結(jié)果的原因很多，包括模版、試劑、引物、操作等，甚至儀器也會(huì)有很大影響。

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5樓2014-08-26 14:32:43

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夢(mèng)鎖深秋2005

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引用回帖:

5樓: Originally posted by johnkm66 at 2014-08-26 14:32:43
P不出來(lái)具體是什么情況？完全沒(méi)有條帶還是有但很淡？PCR不出結(jié)果的原因很多，包括模版、試劑、引物、操作等，甚至儀器也會(huì)有很大影響。

目的條帶一點(diǎn)都沒(méi)有，有時(shí)候會(huì)有一些雜帶，有時(shí)候只有一些二聚體。試劑盒儀器等客觀因素可以排除。

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6樓2014-08-26 15:32:21

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6樓: Originally posted by 夢(mèng)鎖深秋2005 at 2014-08-26 15:32:21
目的條帶一點(diǎn)都沒(méi)有，有時(shí)候會(huì)有一些雜帶，有時(shí)候只有一些二聚體。試劑盒儀器等客觀因素可以排除。...

這樣的話，首先檢查引物設(shè)計(jì)，其次檢查反應(yīng)程序設(shè)計(jì)，第三注意操作細(xì)節(jié)。另外，請(qǐng)注意目標(biāo)片段的大小和GC含量，GC含量高的話，是比較難擴(kuò)的。如果是這樣，需要選擇一些相對(duì)高端的試劑盒，特別是對(duì)高GC含量有專門(mén)說(shuō)明的產(chǎn)品。

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7樓2014-08-27 11:12:38

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同源臂的引物不像功能基因那樣局限性很大，所以引物應(yīng)該不會(huì)有問(wèn)題，P不出條帶換個(gè)PCR酶試試，我P過(guò)陽(yáng)性菌的同源臂普通Taq酶P不出來(lái)，而Primer STAR酶就P出來(lái)了，而且可以縮短退火時(shí)間試試，模板量不要太多。

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8樓2014-08-27 13:50:13

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多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物
進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增試試
另外，擴(kuò)增基因不是提了ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄嗎？

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9樓2014-08-27 16:57:48

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a50044758

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換酶！反應(yīng)體系里面加DMSO！

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10樓2014-08-27 22:55:53

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