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prominetsun金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
關(guān)于Cre/loxP做酵母基因敲除的一些問(wèn)題！求大牛們賜教啊啊�。�！ 已有1人參與
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最近開(kāi)始考慮做基因敲除，也不知道自己做一個(gè)基因敲除的周期是多少天，因?yàn)橐脗�(gè)三五個(gè)基因。。。打算用 Cre/loxP 做基因敲除，找到的文獻(xiàn)都是說(shuō)設(shè)計(jì)的引物前 20 多個(gè)bp是目的基因上下游的同源臂，后面的十幾bp與 pUG6 中 loxP-Marker-loxP 的上下游同源，這樣勢(shì)必會(huì)引入上游和下游的十幾 bp 的堿基，我不明白為什么所設(shè)計(jì)的引物不是直接與 loxP 位點(diǎn)同源這樣擴(kuò)增出的敲除盒正好不包含其他堿基，有點(diǎn)想不明白為什么，第一次接觸這樣的領(lǐng)域，在實(shí)驗(yàn)室也是新手，所以有好多知識(shí)不懂，還請(qǐng)各位大牛們不吝賜教，如果能再詳細(xì)的介紹一下 Cre/loxP 的敲除，怎么構(gòu)建引物，需要做什么工作等切實(shí)可行的方案的話，我將不勝感激！ PS：下面是我抄的一張圖，誰(shuí)能告訴我綠色部分指的是什么？ IMG_20140830_155537.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
prominetsun(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-01 19:26:51
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prominetsun(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-01 19:26:51
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樓主，你好，我最近也在用Cre，不過(guò)不是基因敲除，是酵母內(nèi)目的蛋白熒光檢測(cè)，其中要用到Cre移除標(biāo)記性marker，也在學(xué)習(xí)中，你說(shuō)的引物前20幾個(gè)bp是目的基因上下游的同源臂，后面的十幾bp與 pUG6 中 loxP-Marker-loxP 的上下游同源的這個(gè)問(wèn)題，確切答案我也不是很清楚，至于那幅圖的綠色部分，在丁香園論壇里幾年前有過(guò)壇友分享。（http://www.dxy.cn/bbs/topic/16548414） LoxP（locus of X-over P1）序列：來(lái)源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下： 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5' 相信，你那幅圖中的綠色部分就是這13bp，其中紅色剪頭就是8bp序列的方向。 Cre介導(dǎo)的loxp過(guò)程可分為三種情況： 如你那幅圖 1、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列； 2、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列倒位； 3、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位。 另外，Cre不僅可以識(shí)別LoxP的2個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和8bp的間隔區(qū)域，而且當(dāng)一個(gè)13bp的反向重復(fù)序列或者8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變時(shí)仍能識(shí)別并發(fā)生重組。利用這一特點(diǎn)，人們?cè)跇?gòu)建載體時(shí)可以根據(jù)需要改造LoxP位點(diǎn)序列，以用于特定的基因突變或修復(fù)，增加了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。（以上均為引用丁香園論壇帖子內(nèi)容） 如果有需要的化我可以將介紹蛋白熒光鑒定的這篇protocol文章發(fā)給你供你參考 |
2樓2014-09-01 15:57:04
3樓2014-10-15 21:55:17
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