張冰寶

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[求助] pcr遇到問題，P出的條帶總是比目的條帶高已有3人參與

我的目的條帶是3900bp，跑膠顯示總是在5000bp處，且條帶比較暗。我用的是50微升體系{引物各2ul，水是35ul，buffer5微升。dntp 4ul，模板1.5ul，酶0.5ul}
退火溫度我試了55度，57度，59度。55度和57度條帶較亮但均有引物二聚體。59度沒有引物二聚體但是條帶較暗。。。三個溫度條帶均在5000bp處。
請問各位高手，這個是我的目的條帶嗎？我該怎么解決呢

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1樓 2014-09-03 11:07:32

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chenguestc

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-09-03 18:15:29

如果3個溫度都擴(kuò)增一致，只是亮度不一致，應(yīng)該引物擴(kuò)增不是非特異。
請核實(shí)，你設(shè)計的引物是否最開始時忘了吧內(nèi)含子長度計算在內(nèi)？

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2樓2014-09-03 11:27:24

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-09-03 18:15:36

如果你確定目標(biāo)片段就是3900，那么就把擴(kuò)增產(chǎn)物兩端測序（不能測通，可以每端測幾百bp）再和你的目標(biāo)片段比較或者到NCBI比對看到底是不是你需要的

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3樓2014-09-03 11:29:55

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koujie1986

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-09-03 18:15:42

應(yīng)該是目的條帶，產(chǎn)物有可能帶了一部分內(nèi)含子序列。5kb的長片段條帶亮度暗一點(diǎn)很正常，這跟Taq酶種類、活性有關(guān)。

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4樓2014-09-03 17:26:48

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引用回帖:

2樓: Originally posted by chenguestc at 2014-09-03 11:27:24
如果3個溫度都擴(kuò)增一致，只是亮度不一致，應(yīng)該引物擴(kuò)增不是非特異。
請核實(shí)，你設(shè)計的引物是否最開始時忘了吧內(nèi)含子長度計算在內(nèi)？

初學(xué)，不是很懂，請問一下如何確定自己是否把內(nèi)含子計算在內(nèi)？多謝

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5樓2014-09-04 10:10:12

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4樓: Originally posted by koujie1986 at 2014-09-03 17:26:48
應(yīng)該是目的條帶，產(chǎn)物有可能帶了一部分內(nèi)含子序列。5kb的長片段條帶亮度暗一點(diǎn)很正常，這跟Taq酶種類、活性有關(guān)。

如何確定我是否帶了內(nèi)含子序列呢？我用普通的酶和takara的酶P出來的都是一樣的

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6樓2014-09-04 10:11:41

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張冰寶(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2014-09-04 19:33:39

你用什么模板？5 kb可能是質(zhì)粒模板。
如果用基因組DNA擴(kuò)增，可能是連內(nèi)含子一起擴(kuò)增出來

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7樓2014-09-04 11:17:22

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5樓: Originally posted by 張冰寶 at 2014-09-04 10:10:12
初學(xué)，不是很懂，請問一下如何確定自己是否把內(nèi)含子計算在內(nèi)？多謝...

那你開始設(shè)計的引物的時候是如何設(shè)計的？參考序列是什么？
可以用設(shè)計引物的參考序列到NCBI網(wǎng)站上比對，然后就可以知道了

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8樓2014-09-04 15:10:59

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7樓: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-04 11:17:22
你用什么模板？5 kb可能是質(zhì)粒模板。
如果用基因組DNA擴(kuò)增，可能是連內(nèi)含子一起擴(kuò)增出來

就是基因組 DNA.

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9樓2014-09-04 15:29:17

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8樓: Originally posted by chenguestc at 2014-09-04 15:10:59
那你開始設(shè)計的引物的時候是如何設(shè)計的？參考序列是什么？
可以用設(shè)計引物的參考序列到NCBI網(wǎng)站上比對，然后就可以知道了...

我在genebank上查到我要的基因序列，然后用prime prime 5設(shè)計的引物。

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10樓2014-09-04 15:47:32

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