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Lapatinib對(duì)EGFR和ErbB2的抑制性實(shí)驗(yàn) 已有1人參與
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一、 生理活性 產(chǎn)品描述： Lapatinib可形成Lapatinib的二甲苯磺酸鹽，是一種有效的EGFR和ErbB2抑制劑，IC50分別為10.2和9.8 nM。 靶點(diǎn)： ErbB2 EGFR ErbB4 c-Src C-Raf-1 IC50： 9.2 nM 10.8 nM 367 nM 3.5 μM >10 μM 體外研究： 除了ErbB-4例外, Lapatinib 作用于EGFR 和 ErbB-2比作用于其他測(cè)試的激酶，如c-Src, MEK和ERK選擇性高300多倍。Lapatinib處理，抑制EGFR 和ErbB-2受體自磷酸化，這種作用存在劑量依賴性，作用于 BT474 和HN5 細(xì)胞時(shí)，IC50 分別為 0.17 和 0.08 μM。Lapatinib作用于EGFR-和ErbB-2-過(guò)量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，抑制EGFR 和ErbB-2自磷酸化，比作用于純化酶的效力低10倍左右。另一種EGFR過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞A-431, 與HN5反應(yīng)相似。Lapatinib在抑制 EGFR過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)方面與 OSI-774 相似。 體內(nèi)研究： Lapatinib有效抑制BT474 和HN5 人類移植瘤生長(zhǎng)。使用30和 100 mg/kg Lapatinib 口服給藥攜帶腫瘤的小鼠，每天兩次，抑制腫瘤生長(zhǎng)，這種作用存在劑量依賴性。按100 mg/kg 劑量處理完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。按這種劑量處理，在處理21天期間，有<10%腫瘤損失。 特征： 抑制劑lapatinib已經(jīng)批準(zhǔn)用于治療HER-2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。 二、 信號(hào)通路圖 三、 細(xì)胞試驗(yàn) 激酶實(shí)驗(yàn): 體外EGFR, ErbB-2,和 ErbB4激酶實(shí)驗(yàn)： 從桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中純化EGFR, ErbB-2, 和 ErbB4的細(xì)胞內(nèi)激酶域。EGFR, ErbB-2, 和 ErbB-4 反應(yīng)在96孔聚苯乙烯圓底板中進(jìn)行，終體積為45 μL。反應(yīng)混合物含50 mM 4-嗎啉基丙磺酸(pH 7.5), 2 mM MnCl2,10 μM ATP, 1 μCi [γ-33 P] ATP/每次反應(yīng),50 μM Peptide A [生物素-(氨基酸)-EEEEYFELVAKKK-CONH2],1 mM 二硫蘇糖醇, 及 1 μL 含連續(xù)稀釋Lapatinib（初濃度為10 μM）的 DMSO。加入指定純化的1型受體細(xì)胞內(nèi)域開(kāi)始反應(yīng)。加入的酶量為1 pmol/每次反應(yīng) (20 nM)。在23oC反應(yīng)10分鐘，加入溶于水的 45 μL 0.5% 磷酸后，終止反應(yīng)。最終反應(yīng)混合物(75 μL) 轉(zhuǎn)移到磷酸纖維素過(guò)濾板上。過(guò)濾實(shí)驗(yàn)板，使用200 μL 0.5% 磷酸沖洗三次。每孔中加入閃爍混合物(50 μL),使用Packard Topcount計(jì)數(shù)而量化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 細(xì)胞系： HFF , BT474, MCF-7, N87, CaLu-3, HN5, A-431, T47D, HB4a, 和 HB4a c5.2 濃度： 0 到 100 nM 處理時(shí)間： 3 天 方法： 按以下密度接種細(xì)胞：HFF, 1.5×104 個(gè)細(xì)胞/cm2; BT474, MCF-7, N87, 和 CaLu-3, 3×104 個(gè)細(xì)胞/cm2; 及HN5, A-431, T47D, HB4a, 和 HB4a c5.2, 1×104 個(gè)細(xì)胞/cm2，使在實(shí)驗(yàn)期間細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。24 小時(shí)后,使用濃度范圍為0 到 100 nM的Lapatinib處理細(xì)胞。在含5% FBS, 50 μg/mL gentamicin, 和 0.3% v/v DMSO的低糖DMEM培養(yǎng)基中處理HFF, BT474,HN5, 和 N87 細(xì)胞。在50% 高糖DMEM,和50%含5% FBS, 50 μg/mL gentamicin, 和 0.3% v/v DMSO的低糖DMEM中處理MCF-7細(xì)胞。在 50% RPMI,50%含 5% FBS, 50 μg/mL gentamicin, 和 0.3% v/v DMSO 的低糖DMEM中處理T47D, A-431, 和CaLu-3 細(xì)胞。在50% DMEM, 50% 含5% FBS, 2.5 μg/mL hydrocortisone, 2.5 μg/mL 胰島素, 25 μg/mL hygromycin B, 50 μg/mL gentamicin, 和 0.3% v/v DMSO的RPMI 1640中處理HB4a 和 HB4a c5.2細(xì)胞。3天后, 使用亞甲基藍(lán)染色測(cè)評(píng)相對(duì)細(xì)胞數(shù)。移除培養(yǎng)基，每孔加入溶解在 50% 乙醇和50% 水中的100 μL 0.5% w/v亞甲基藍(lán)。浸泡在去離子水中洗滌實(shí)驗(yàn)板，然后在空氣中烘干。每孔加入溶解在PBS的1% w/v n-lauroylsarcosine(100 μL), 然后實(shí)驗(yàn)板在室溫下溫育30分鐘。使用Spectra酶標(biāo)儀在620 nm處測(cè)定吸光值。 四、 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物模型： 雌性CD-1裸鼠和雌性C.B-17 SCID 小鼠 配制： 磺丁基醚-β-環(huán)糊精的10％水溶液 劑量： 100 mg/kg 給藥處理： 口服，每天兩次 溶解度： 15% Captisol, 30 mg/mL * 溶解度檢測(cè)是由Selleck技術(shù)部門(mén)檢測(cè)的，可能會(huì)和文獻(xiàn)中提供的溶解度有所差異，這是由于生產(chǎn)工藝和批次不同產(chǎn)生的正�，F(xiàn)象。 |
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2樓2018-03-14 00:37:10
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