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[交流]
最近細(xì)胞受支原體污染，實驗室在尋找解決辦法
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剛開始并沒有在意，可是污染越來越嚴(yán)重，所有人的實驗都進(jìn)行不下去了，不得已，打算先甲醛和高錳酸鉀熏蒸（用量：甲醛40%濃度加10ml /立方米，高錳酸鉀5g/立方米），熏蒸完畢之后再將細(xì)胞加抗支原體藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)，抗支原體藥還沒決定買哪家的。 大家有什么好的建議，希望賜教。 |
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唐亦悠悠: 回帖置頂 2014-09-29 23:05:06
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唐亦悠悠: 回帖置頂 2014-09-29 23:05:06
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1、Q: 支原體污染對細(xì)胞有什么危害？ A: 支原體污染后，不會使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì) 胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細(xì)胞收到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形， 影響 DNA 合成，抑制細(xì)胞生長等，以致影響實驗數(shù)據(jù)的可信度。 2、Q: 支原體污染有什么特征？ A: 細(xì)胞狀態(tài)變差,生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生 渾濁。細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點，細(xì)胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì)胞漂浮，完全死亡。具體特征請見附件 2。 3、Q: 細(xì)胞培養(yǎng)時，顯微鏡下的小黑點是什么？ A: 支原體污染后，細(xì)胞凋亡壞死，釋放出大量碎片，看起來就像小黑蟲子。 4、Q: 細(xì)胞通過何種途徑感染支原體？ A: 支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群如口腔中的支原體）、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染等等，由于支原體大小為 0.1~0.8 um，無細(xì) 胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um），血清中也可能含有支原體。 5、Q: 支原體污染如何檢測？ A: 利用支原體具特殊專一性之 primers，經(jīng)由 PCR 反應(yīng)來復(fù)制支原體 DNA。所用 primers 來自支原體的 conserved 16S-23S rRNA 序列，由于此段序列依支原體種類不同而不同， 因此可依所復(fù)制之 DNA大小及其 restriction fragment 大小差異來作偵測與鑒定支原體。 （具體方法見附件）。 6、Q: 如何清除支原體？ A: 由于市場同類產(chǎn)品都為抗生素類，對細(xì)胞本身也會產(chǎn)生一定影響，而且有反復(fù)發(fā) 作的風(fēng)險，吉銳生物推出的 MycoplasmaOUT?Treatment，活性成分為抗菌肽，經(jīng)多方測試表明對大部分細(xì)胞無毒害作用，因其獨特的作用原理，支原體不會對其產(chǎn)生耐藥性，并且其作用時間短，在三天內(nèi)就可殺滅支原體，并自動降解成氨基酸，不會對細(xì)胞造成二次污染。 7、Q: 為什么在培養(yǎng)細(xì)胞前要加入MycoplasmaOUT? Prevention？ A：由于支原體污染后能夠進(jìn)入細(xì)胞，而MycoplasmaOUT? Prevention不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)也就不能殺滅已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的支原體，而這部分細(xì)胞死亡時會釋放其內(nèi)部的支原體，需要MycoplasmaOUT?Prevention來殺滅新釋放出的支原體，以防止新生細(xì)胞受到污染。 8、Q: 所謂的黑膠蟲污染？ A:培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)小黑點現(xiàn)象很嚴(yán)重，原來對“黑膠蟲”一說嗤之以鼻，認(rèn)為那不過是自欺欺人的借口，覺得怎么也不會發(fā)生在自己身上。但是真的就碰上了：細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點，細(xì)胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì)胞漂浮，完全死亡。 上述現(xiàn)象很像所謂的“黑膠蟲”。 我感覺實際是支原體感染以后細(xì)胞生長不好造成的碎片和感染原蟲（現(xiàn)在看來是些胞外囊泡）的混合體。這種現(xiàn)象的直接原因是支原體等原蟲感染，間接表象是小黑點，被以訛傳訛成為了“黑膠蟲”。 光鏡下看不到支原體，但是可以看到支原體感染的終末現(xiàn)象——細(xì)胞凋亡壞死，釋放出大量碎片，看起來就像小黑蟲子。 查找類似的帖子——很多人是更換血清后出現(xiàn)這種問題； 說空氣傳播的可能是一個培養(yǎng)箱的人都用了同一種血清，而不是可以通過培養(yǎng)箱空氣傳播；感染最可能是牛源性的支原體，通過產(chǎn)道或血行感染。 所謂“細(xì)胞生長不受影響”，其實是污染的嚴(yán)重程度不高而已； 支原體污染嚴(yán)重就出現(xiàn)細(xì)胞大量空泡形成，細(xì)胞間空曠地帶出現(xiàn)大量黑點，細(xì)胞最終凋亡、壞死，漂起來。有些國產(chǎn)血清寫著建議滅活，其實是掛羊頭賣狗肉，那個56度30分鐘更多的是為了殺殺支原體的。實際上還有很多殺不死的。但可以降低產(chǎn)品支原體等微生物污染風(fēng)險。用阿奇霉素殺支原體，小黑點可以得到抑制，不過我想根治就很難了，而且處理時間很長，至少一個星期。 以上是自己個人總結(jié)的一點看法。建議不要總拿子虛烏有的“黑膠蟲”來說事。多考慮看不到的支原體，不要還停留在培根時代——只相信自己眼睛看見的。 |
16樓2014-09-29 13:30:03
youlinglyw
榮譽(yù)版主 (著名寫手)
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專家經(jīng)驗: +37 - BioEPI: 5
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- 蟲號: 787036
11樓2014-09-21 12:04:25
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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| 用甲醛的話那你們實驗室至少一個星期不用做實驗了，支原體污染建議看看這個http://wenku.baidu.com/view/d8f6f6a3a0116c175f0e485f.html，實驗室除菌的話建議用一些無害的，有興趣的話可以聯(lián)系我 |
12樓2014-09-22 10:43:05
13樓2014-09-23 11:52:31
14樓2014-09-25 09:43:38
15樓2014-09-25 11:13:20
17樓2014-09-29 15:22:33
18樓2014-09-29 23:00:50
19樓2014-09-30 09:29:53
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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碧云天支原體清除試劑，物美價廉，但濃度不能太高，否則影響細(xì)胞狀態(tài)。持續(xù)給藥兩周可以清除，個人覺得不是特別重要的細(xì)胞，扔之，建議重新復(fù)蘇，祝順利！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
34樓2019-11-30 01:14:24
簡單回復(fù)
2014-09-21 11:25
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唐亦悠悠(金幣+1): 謝謝參與
dmbb3樓
2014-09-21 11:28
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lyy4124樓
2014-09-21 11:36
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552365樓
2014-09-21 11:38
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哈密瓜哈密瓜6樓
2014-09-21 11:39
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2014-09-21 11:40
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neu2348樓
2014-09-21 11:46
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唐亦悠悠(金幣+1): 謝謝參與
2014-09-21 11:55
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shenrenren10樓
2014-09-21 11:58
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愛笑的Q25樓
2014-10-27 15:40
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淡然微笑11628樓
2014-10-27 17:15
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PCR
huangwensh32樓
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