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愛(ài)你的小蟲(chóng)新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
各位大哥大姐，希望你們能幫我分析分析
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各位大哥大姐，小弟現(xiàn)在寢食難安，做westernblot 遇到了個(gè)難題，請(qǐng)求你們的幫助。 小弟感覺(jué)蛋白時(shí)常會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，好幾次都是同一個(gè)樣品前面兩次做得齊了，后面就越來(lái)越不齊，呈毛毛蟲(chóng)樣或者干脆就不出，蛋白即使加了4倍也有不出的。為什么會(huì)這樣呢？好好的蛋白就怎么不行了? 小弟提取的蛋白是胰腺組織全蛋白，步驟如下： 1.取血后用鑷子摘取胰腺組織。 2.胰腺組織入預(yù)冷PBS中，洗血后分若干部分，裝入冰中。待全部取完放入-80冰箱。 3.取預(yù)冷的含pmsf 的碧云天裂解液400ul，插入冰中，取組織約60mg加入裂解液中。 4.電動(dòng)勻漿器3檔勻漿約20s，離心管一直插在冰中。 5.勻漿結(jié)束后冰中裂解30min，離心2000r/m，取上清超聲5s*5s，再離心12000r/m，取上清。 6.測(cè)蛋白濃度，約半小時(shí)。 7.算體積，加入五成sds上樣緩沖液，體積為蛋白量除4，沸水中變性7min中。分裝成兩份，一份-20，另一份-80冰箱保存。 小弟每次用細(xì)胞蛋白，都做的還可以，每個(gè)條帶都出，細(xì)胞蛋白還是4個(gè)月前的。做細(xì)胞的抗體甚至是做組織蛋白白板回收的抗體。小弟現(xiàn)在懵了，組織蛋白到底是怎么了？謝謝各位了 |
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