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蠹魚木蟲 (正式寫手)
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[求助]
換載體，pET21a換成pET32a的酶切位點(diǎn)問題 已有4人參與
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用Nde I 和Hind III 雙酶切目的片段以及空載體pET21a，構(gòu)建了一個(gè)重組質(zhì)粒來表達(dá)一個(gè)酶，但是至今未表達(dá)�？赡苁悄鞘浅霈F(xiàn)了問題呢？ 我想換個(gè)載體，用pET32試一下。Hind III 只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，可以沿用。但是pET32上有2個(gè)Nde I 的切割位點(diǎn)，這樣可以嗎？會(huì)不會(huì)切的亂七八糟的？應(yīng)不應(yīng)該設(shè)計(jì)引物，PCR重新構(gòu)建酶切位點(diǎn)呢？ 剛剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，懇請(qǐng)大家多多指點(diǎn)。 另外，我還想換成pBAD質(zhì)粒，這個(gè)酶切位點(diǎn)怎么選，怎么辦？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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蠹魚: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-09-28 19:11:39
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未表達(dá)可能原因宿主菌BL21（DE3）是否正常、誘導(dǎo)條件是否為最優(yōu)、基因內(nèi)部是否有稀有密碼子。 換32a就不能用Nde I了，需要重新設(shè)計(jì)引物，酶切位點(diǎn)可以換成NcoI或者BamHI。另外，pBAD系列的載體酶切位點(diǎn)也不一樣啊 |
2樓2014-09-28 18:09:55
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3樓2014-09-28 18:29:14
蠹魚
木蟲 (正式寫手)
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4樓2014-09-28 19:12:47
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蠹魚
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7樓2014-09-29 15:37:11
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