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feiadafeng銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
高壓均質(zhì)以及透析時間對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響
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本人剛進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與提純的實驗，是重復(fù)老板的實驗。目的蛋白的功能要求有折疊。 由于目的蛋白具有很多ELP的重復(fù)序列，加上目的質(zhì)粒是pQE系列的，所以蛋白表達(dá)時間過長會出現(xiàn)降解情況。 均質(zhì)是在1000bar-1500bar，2次。均質(zhì)后性狀為含有懸浮顆粒的濁液，40000g，20min得到清液，過柱提純。 SDS-PAGE結(jié)果證明了是目的蛋白，純度不低。之后4度攪拌下進(jìn)行透析。 有以下幾種現(xiàn)象： 1.透析時間超過48小時后（換了約6次水，白天是6-8小時一換，晚上過夜）出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。40000g離心可得清液。 2.清液凍干時發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)長條蘑菇狀，而非一些蓬松棉花狀。 3.結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水溶性極差（目標(biāo)蛋白應(yīng)該有極好的水溶性） 老板非說是均質(zhì)壓力過高，而且沒加溶菌酶（均質(zhì)前只加了PMSF/Mg離子/DNase）導(dǎo)致的蛋白質(zhì)可能結(jié)構(gòu)有問題，而且不是透析時間過長導(dǎo)致的。 請問有沒有富有經(jīng)驗的人能夠分享一下經(jīng)驗，或者指出一些可能的操作問題？多謝！ |
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