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PacBio長讀長致力醫(yī)學(xué)研究
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供體源性感染黃金審判：PacBio助力感染菌株基因組重測序 ——Genomeweb Andrew Kasarskis訪談錄 Andrew Kasarskis博士是Icahn基因中心遺傳與基因組中心的副主任。他目前領(lǐng)導(dǎo)著一些專攻治療和診斷的合作項(xiàng)目，而他自己的研究也主要在病原體檢測，藥物基因組學(xué)，睡眠與遺傳的關(guān)系幾個方面展開。在加入西奈山之前，他曾經(jīng)就職于PacBio，Sage Bionetworks和Merck。他有超過10年的研發(fā)和項(xiàng)目管理經(jīng)驗(yàn)。 2014年10月8號，Genomeweb對Arew Kasarskis博士就測序平臺在檢測供體源性感染的作用進(jìn)行了探討。根據(jù)最新的兩起病例報道，全基因組測序（WGS）在這方面起到了非常重要的作用，讓醫(yī)生明白從已感染的供體移植器官是一件多么危險的事情。 第一個病例是由美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）報道的，并且9月份已經(jīng)在American journal of Transplantation發(fā)表。他們通過WGS的方式確診，有2名病人分別移植了同一名受感染的供體器官，結(jié)果都發(fā)生耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染。另一個病例，是西奈山的研究人員獨(dú)立報道，也是通過WGS確診一名受體病人由于移植了一名受感染供體的肝臟導(dǎo)致MRSA感染。兩起報道都認(rèn)為，有限的可供移植器官和越來越龐大的等待器官移植的病人名單給醫(yī)生很大的壓力，使他們不得不考慮移植明知已經(jīng)感染供體的器官。目前，急需一份有力的數(shù)據(jù)，來說明移植這種已感染器官的風(fēng)險以及這種移植方案后續(xù)帶來龐大治療支出。至今為止，只有幾例疑似供體源性感染的病例使用精確的方法確診，例如WGS，而其它的案例都是基于其它相對不太準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)進(jìn)行診斷。這些不準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)對于統(tǒng)計準(zhǔn)確的移植傳輸病原感染率，移植風(fēng)險，后續(xù)治療費(fèi)用計算帶來了阻礙。 Andrew Kasarskis曾對Clinical Sequencing News說：“現(xiàn)在，我們還無法給出這方面的臨床應(yīng)用指南，因?yàn)槲覀內(nèi)狈?shù)據(jù)，我們不確定從一個已被感染的供體體內(nèi)取出器官移植到另一名受體身上到底有多大的風(fēng)險。”據(jù)Kasarskis說，以前那些低分辨率的檢測手段，大部分現(xiàn)在已經(jīng)棄之不用，因?yàn)樗麄儾荒転橐伤乒w源性感染的案例提供可信的證據(jù)�！耙郧拔覀兂Ｓ枚辔稽c(diǎn)序列分型（MLST）的方法來鑒定的病原體克隆，例如，你通過MLST可能分析得到這是一個USA300的克隆。但是，問題在于每個醫(yī)院到處都漂浮著類似的病原，你無法區(qū)分這個克隆是來自移植傳輸還是其它什么地方�！� 在第一起報道中，焦點(diǎn)在于在2個感染MRSA的受體病人中，都接受了同一個供體的器官，一個是肝臟移植，一個是肺部移植。檢測出來的病原體都是USA300，除了測序，沒有任何一種其它技術(shù)可以確定這個菌株是否都來源于供體，還是來源于醫(yī)院其它方面的感染。所以CDC的研究人員使用Illumina MiSeq的技術(shù)對2個受體病人分離的MRSA和他們共同的供體分離的MRSA進(jìn)行了測序，結(jié)果說明3個菌株非常相似，而且明顯區(qū)分于醫(yī)院分離的其它MRSA。 在第二期報道中，西奈山的研究案例是從一個MRSA感染的二尖瓣心內(nèi)膜炎供體移植肝臟后，受體也發(fā)生了移植后的MRSA感染。研究人員使用PacBio RSII對供體和受體分離的MRSA進(jìn)行了長讀長的測序并完成了Denovo的組裝，結(jié)果證明2個分離菌株的序列100%相同，是一個非常確鑿的用來證明供體源性感染的證據(jù)。 在這兩起報道中，相同的情況是供體和受體分離的菌株，都是MRSA的USA300。而美國幾乎所有醫(yī)院獲得性的MRSA菌株都是USA300，所以，必須使用全基因組測序并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行拼接組裝才能夠確定受體的分離株是否是供體來源。Kasarskis認(rèn)為：“測序可以給出無可置疑的結(jié)果，告訴我們受體的病原是否來自供體。”“而這部分工作對于彌補(bǔ)從被感染的供體移植器官是否符合臨床安全的數(shù)據(jù)也非常重要�！� 在第一起報道中，CDC的研究人員也提到，2個被感染的受體都進(jìn)行了抗生素治療，但是隨后其中之一已經(jīng)治療完畢并出院的受體病人的MRSA復(fù)發(fā)了，這說明我們現(xiàn)有的治療標(biāo)準(zhǔn)對于預(yù)防細(xì)菌傳輸還是不足的。同一個供體的器官，腎和胰腺也移植給了另外兩個受體病人，而移植后進(jìn)行了預(yù)防性的抗體治療，他們并沒有出現(xiàn)MRSA感染的跡象。 兩起報道中都強(qiáng)調(diào)，測序是確定供體源性感染非常好的手段，也有助于理解傳輸發(fā)生的負(fù)責(zé)模式，促進(jìn)臨床的治療模式，預(yù)防MRSA或者其他細(xì)菌在移植或者其他臨床領(lǐng)域的擴(kuò)散。 突破性進(jìn)展：如何追蹤抗生素耐藥細(xì)菌抗性基因的來源？ 根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，“抗抑菌劑基因的出現(xiàn)對于由細(xì)菌、寄生蟲、病毒及真菌所引起的感染疾病的預(yù)防與治療帶來了很大的挑戰(zhàn)，在后抗生素時代，看似普通的感染有可能扼殺一條生命不再是不切實(shí)際的幻想，而正逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)”。 通常抗抑菌劑基因的獲得是由細(xì)菌內(nèi)可動遺傳因子元件介導(dǎo)的致病菌間或者是致病菌和共生體間交換的結(jié)果，因此，獲得抗抑菌劑基因所處的遺傳環(huán)境對于了解抗抑菌劑基因的移動就顯得非常重要。通過PCR或高通量二代測序的方法可以很容易檢測到抗抑菌劑基因的存在，然而這些方法自身的一些局限性使得其很難精確地檢測這些基因所處的遺傳環(huán)境。而PacBio RS II SMRT單分子測序技術(shù)，利用其特有的讀長優(yōu)勢可以克服這些局限從而追蹤含抗抑菌劑因的致病菌在醫(yī)療環(huán)境中的傳播。 細(xì)菌間遺傳因子的水平轉(zhuǎn)移是通過由細(xì)菌染色體所分離出來的質(zhì)粒、小DNA分子來實(shí)現(xiàn)的。Conlan等科學(xué)家通過對2011年美國NIH臨床診斷中心爆發(fā)的那次疫情中病人中分離到的致病菌進(jìn)行PacBio長讀長測序分析，鑒定出致病菌質(zhì)粒含有blaKPC基因，該基因可以編碼碳青霉烯酶從而水解碳青霉烯抗體。Conlan又對1000多個感染抗碳青霉烯抗體致病菌病人進(jìn)行監(jiān)測，從這些病人中分離出細(xì)菌基因組并進(jìn)行PacBio SMRT長讀長測序分析，得到了63個質(zhì)粒的完整序列，這些完整的質(zhì)粒序列信息讓我們對致病菌質(zhì)粒的多樣性有了具體的了解，而這些是任何其他測序方法所不能完成的。 質(zhì)粒在抗抑菌劑基因的轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用，抗抑菌劑基因通常以模塊化的基因簇形式聚集在一起增加了它們的抑菌性。一些插入序列，如IS26，將抗抑菌劑基因在基因組序列張間隔排列，像轉(zhuǎn)座子一樣可以到處移動；還有一些因子，如ISEcp1，可以移動其相鄰的基因，從而產(chǎn)生許多抗抑菌劑基因拷貝存在于基因組內(nèi)。這些插入序列及其他一些因子的存在是二代測序基因組組裝不完整的主要原因，只能得到許多染色體序列片段及質(zhì)粒序列片段，在這種意義上說，質(zhì)粒序列信息是二代測序基因組組裝的“黑洞“，在許多基因組組裝研究中都要規(guī)避復(fù)雜結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒的存在。Colan等在本研究中的基因組比較結(jié)果表明抗抑菌劑基因的結(jié)構(gòu)及序列排列信息只有通過PacBio長讀長測序獲得完整質(zhì)粒序列信息的情況下才能夠拿到。 傳統(tǒng)的Sanger測序是組裝和分析抗抑菌劑細(xì)菌質(zhì)粒的金標(biāo)準(zhǔn)，然而這種方法在測序前需要分離和構(gòu)建不同的高質(zhì)量的質(zhì)粒文庫，在技術(shù)層面存在很大困難，并且成本也非常之高。短序列測序的二代測序可以很經(jīng)濟(jì)地獲得很多有重復(fù)序列所分割的Contig，由于這些重復(fù)序，通常是些移動因子（如插入序列），在質(zhì)粒中存在很多拷貝，因此在組裝完整質(zhì)粒序列方面就存在很大困難。從任何細(xì)菌中獲得抗抑菌劑基因都可以很容易地做到，但是如何將這些質(zhì)粒中的序列完整地組裝起來是最大的困難，而組裝完整的質(zhì)粒序列對于我們在臨床上理解這些基因是如何傳播的非常關(guān)鍵。作為比較， PacBio長讀長測序可以使我們獲得完整的細(xì)菌質(zhì)粒圖譜，包括數(shù)量、位置及抗抑菌劑基因的移動因子等具體信息。這些信息也極大地幫助我們?nèi)ダ斫赓|(zhì)粒的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移、流行病及進(jìn)化情況。 關(guān)于Pacbio RS II測序系統(tǒng) 天津生物芯片于2013年引進(jìn)國內(nèi)首批PacBio RS II測序儀系統(tǒng)，將PacBio RS II測序平臺與二代測序平臺相結(jié)合， 目前可以達(dá)到平均8K以上的讀長，它應(yīng)用于小基因組完成圖、動植物復(fù)雜基因組組裝、表觀基因組學(xué)、全長轉(zhuǎn)錄組測序等方面。 原理 1. 用4種熒光分別標(biāo)記4種dNTP 2. 在測序芯片的底部做出許多用與入射光波長相應(yīng)的小孔，特定的孔徑保證了入射光在小孔中只以走很短的矩離。只夠照到正好與酶在相互作用的熒光dNTP底物 3. 把聚合酶錨定在測序芯片的底部 4. 讓DNA鏈與酶結(jié)合，進(jìn)行測序 5. 測序時，熒光dNTP與酶+DNA模板型成復(fù)合物，短暫結(jié)合 6. 熒光dNTP被激光照射，發(fā)出熒光，熒光被檢測到 7. 酶反應(yīng)過程，一方面使鏈延伸，同時使dNTP上的熒光基團(tuán)脫落 8. 聚合反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，測序同時持繼進(jìn)行 |
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