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關于病毒免疫方面抗原表位預測的經驗分析 已有15人參與
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本人也正在做這方面的工作，因為是初次接觸免疫學放面的知識，一路坎坷。查了不少這方面的東東，與你分享一下吧，不知是否有幫助？都是從各文獻總結的。 1、B細胞表位預測對于多種免疫學研究是必不可少的。針對不同的蛋白，應選擇不同的方法。一般來說，蛋白質的C端具有較好的親水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原決定簇區(qū)域。本課題選用的蛋白質C-末端序列標簽都是唯一的、或是其家族中的幾個成員所共有的。在人蛋白質中，約81%的蛋白質其C末端的5個氨基酸殘基的小肽是該蛋白質所特有的，制備針對蛋白質C末端小肽的抗體，常常能得到特異性識別該全蛋白的抗體。另外，蛋白的二級結構是B細胞表位計算機預測的重要參數之一，β轉角為凸出結構，多出現在蛋白質抗原表面，有利于與抗體結合，較可能成為抗原表位。而α螺旋和β折疊結構規(guī)則不易變形，較難結合抗體，一般不作為抗原表位。含有5個以上的氨基酸殘基的轉角又常稱為環(huán)(loop)。以往的研究表明，蛋白表面的loop區(qū)可能為功能性抗體的識別位點，特異性好，可及性強。本課題選用的HPO、G-CSF、HSA空間結構已明確，所以直接選擇loop區(qū)或無規(guī)卷曲作為B細胞表位。 舉例： 人Pif1基因編碼至少兩種蛋白亞型，分子量分別為74kDa和80kDa，與酵母具有高度的同源性，α型和β型Pif1只有C末端不同[20]，其余部分完全相同，并且二者的C末端在蛋白數據庫中都是唯一的，選擇α型和β型的C末端作為B細胞表位，既滿足特異性的需要，也能區(qū)分亞型。 GPAA1是一種跨膜蛋白，原核表達非常困難，形成包涵體，且包涵體難以溶解和復性。對這一類型的蛋白，非常適合選擇其特有的B細胞表位免疫動物，來最終制備識別全蛋白質的抗體。ABCpred是基于人工神經網絡模型的線性B細胞表位預測工具，該系統(tǒng)檢驗了源于Bcipep數據庫的700個非冗余B細胞表位和源于Swiss-Prot數據庫的700個長度為10~20個氨基酸的隨機選擇多肽，準確率近66%。Bepipred結合隱馬爾科夫模型和親水性參數評分預測線性B細胞表位，AROC評分達到0.671。將兩種預測方法得到的預測結果進行比較，其共有的預測表位是真正B細胞表位的幾率更大，如果能進一步結合蛋白質二級結構預測結果，就可以選出可信度更高的B細胞表位。如何選擇有效的B細胞表位是能否實現無完整蛋白質抗原條件下抗體制備的關鍵。 2、對于B細胞表位的選擇，對于已有空間結構信息的蛋白質抗原，直接選擇蛋白分子表面的loop區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū)域的小肽序列作為候選B細胞表位；對于缺乏空間結構信息的蛋白質抗原，需要根據蛋白質抗原的特點具體分析。若蛋白質抗原C末端的序列親水性好，可以選擇C末端的6～10個氨基酸的序列作為候選B細胞表位，并且最好該序列為該蛋白質所特有；也可采用B細胞表位預測程序進行分析，選擇不同程序預測的共有B細胞表位；對于同源性很高的家族蛋白，根據序列比對結果選擇差異較大的區(qū)域，并且所選序列應該符合B細胞表位的特征�；谝陨显瓌t，本實驗選擇了10個蛋白的14個表位，并對其中的12個表位進行了驗證。 3、對于B細胞表位的選擇， （1）對于空間結構已知的蛋白質，直接選擇蛋白分子表面的loop區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū)域的小肽序列。 （2）對于空間結構未知的蛋白質，可采用以下策略進行選擇： A：若蛋白質C末端序列的親水性好，可以選擇C末端的6～10氨基酸的序列作為候選B細胞表位，最好該序列為該蛋白質所特有�？刹捎肧IB BLASTNetwork Service（http://www.expasy.ch/tools/blast/）的BLAST軟件進行比對，數據庫選擇homo sapiens； B：采用B細胞表位預測程序ABCpred和BepiPred等進行表位預測，選擇不同程序預測的共有B細胞表位； C：對于同源性很高的蛋白質，首先根據序列比對結果選擇差異較大的區(qū)段，并且所選序列應該符合B細胞表位的特征。 4、二級結構預測 分別應用EX-PASY服務器(http: //www. expasy. org/tools)上的GOR4[4]、HNN (Hierarchical Neural Network meth-od)、SOPMA、nnPredict[University ofCalifornia atSanFrancisco (UCSF)]等方法。 親水性、柔韌性、表面可能性和抗原表位預測 應用DNAstar軟件的子程序Protean,采用Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案預測氨基酸的親水性[5, 6],采用Karplus-Schultz和Emini方案預測柔韌性及表面可能性[7, 8],采用Jameson-Wolf方案[9]和吳氏抗原指數法[10]預測潛在的B細胞抗原表位。 5、 對獲取序列的生物信息學處理分析 使用DNASTAR軟件分析獲取的序列,結合NCBI上的BLAST尋找最匹配的短序列。用全部和部分肽序列查詢各國專利數據庫: http: //appft1. uspto. gov/netahtml/PTO/search-adv. ht/ http: //www. freepatentsonline. com /5194592. htm / http: //www. stcsm. gov. cn/resource/data/zhuanl.i asp#1 使用蛋白質在線分析工具分析多肽的疏水性、PI值、穩(wěn)定性: http: //www. expasy. org/ http: //www. rcsb. org/pdb/cgi/explore. cg?i pdbId=1fi6 http: //www. rcsb. org/pdb/search/searchSequence. do http: //www. expasy. org/sitemap. html http: //www. expasy. org/tools/#translate http: //www. expasy. org/tools/blast/ 常用數據庫和預測工具：名稱 網址 說明 ABCpred http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred 人工神經網絡線性B 細胞表位預測工具 AgAbDb http://202.4 1.70.51:8080/agabdb2/ 抗原-抗體共結晶結構的分子相互作用數據庫 AntiJen http://www.jenner.ac.uk/AntiJen B 細胞表位定量結合數據庫 Bcipep http://www.imtech.res.in/raghava/bcipep/ B 細胞表位數據庫 Bepipred http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred 基于序列的線性表位預測工具 CEP http://bioinfo.ernet.in/cep.htm 基于結構的連續(xù)性和非連續(xù)性表位預測工具 DiscoTope http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope 基于序列/結構的非連續(xù)性表位預測工具 Epitome http://www.rostlab.org/services/epitome 抗原-抗體相互作用殘基數據庫 HIV database http://www.hiv.lanl.gov/content/immunology HIV免疫表位數據庫 IEDB http://www.immuneepitope.org T細胞和B細胞表位數據庫含陰性數據 IEDB B-cell http://www.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input 基于序列的線性表位預測工具 epitope tools 6、B細胞表位預測的方法及應用 線性表位的預測方法 B細胞表位的預測方法主要集中于線性表位，在二十世紀七、八十年代發(fā)展起來的大量的預測B細胞表位的算法都是基于蛋白質序列。這些算法包括：⑴蛋白質的親水性算法(Hydrophilicity)：認為蛋白質各氨基酸殘基可分為親水殘基和疏水殘基兩類。在機體內，疏水性殘基一般被埋在蛋白內部，而親水性殘基位于蛋白質表面，因此，蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有著密切的聯系。Hopp-Woods(Hoop TP et al.,1981)算法為最常用的。⑵可及性算法(Accessibility)：常用的有Janin可及性參數，即指蛋白質抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性(Rudolph R et al.,1990)。它反映了蛋白質抗原各個氨基酸殘基的分布情況。⑶蛋白質可塑性算法(Flexibility)：此算法認為蛋白質抗原構象的多肽鏈骨架具有一定程度的活動性，活動性強的氨基酸殘基即可塑性大，易形成抗原表位(Karplus PA et al.,1985)。⑷蛋白質二級結構預測算法(Secondary structure)：該算法認為蛋白質二級結構與蛋白質表位的分布關系密切。α螺旋、β折疊化學鍵鍵能比較高，形態(tài)固定，常處于蛋白質內部，難以與抗體嵌合，而β轉角和無規(guī)則卷曲多處于蛋白質的表面，結構松散，易展示在蛋白質表面，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性大(來魯華,1993)。⑸蛋白質抗原性算法(Antigenicity)：Welling(Welling GW.,1985)通過對20個已研究得很透的蛋白質的69個連續(xù)位點的606個氨基酸統(tǒng)計分析，用各氨基酸殘基在已知B細胞表位中出現的百分率與其通常在蛋白質中出現的百分率比值的對數建立了抗原性刻度，并以此計算蛋白中各亞序列的抗原性。這些方法的代表軟件有PEOPLE(Alix AJ et al.,1999)、PREDITOP(Pellequer JL et al.,1993)、BEPITOPE(Odorico M et al.,2003)、Bcepred(Saha S et al.,2004)等。但是最近Blythe及Flower(Blythe MJ et al.,2005)對氨基酸的性質與線性表位的關系做了一個評估，結果表明基于氨基酸序列信息來預測線性表位，即使很好的結合了氨基酸的各種性質，其預測結果僅略強于隨機預測。近年來，一些應用隱形馬爾可夫模型(HMM)、人工神經網絡(ANN)、支持向量機算法(SVM)及其他技術的機器研究方法(Ponomarenko JV et al.,2007)已經被引入來預測B細胞表位，取得了較好的結果。代表軟件有ABCpred(Saha S et al.,2006)、BepiPred(Larsen JEet al.,2006)、APP(Chen J et al.,2007)等。ABCpred采用人工神經網絡來預測線性表位，從Bcipep和SwissProt數據庫中提取非冗余的表位肽和非表位肽作為訓練集，采用5-折交叉驗證，預測敏感性約為67%，特異性約為64%。BepiPred結合氨基酸的性質（親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉角）和隱形馬爾可夫模型來預測線性表位，預測結果表明，同那些僅依賴于氨基酸性質的預測方法相比，BepiPred預測結果的準確性有一定程度的提高。Chen et al.(2007)發(fā)現氨基酸通常成對出現在抗原表位的頻率要比其出現在非表位肽段的頻率高，基于此，并聯合支持向量機算法建立了APP方法。應用此方法在872個表位肽和872個非表位肽數據集中，采用5-折交叉驗證，預測準確度為71%。Yasser EL-Manzalawy(EL-Manzalawy Y et al.,2008)等采用同一數據集對這三種方法進行比較，結果表明ABCpred預測表位的準確性略高于BepiPred及APP。 構象表位的預測方法目前，絕大多數B細胞表位預測方法都是基于蛋白質的一級或二級結構的，但這些方法只能用來預測由連續(xù)的氨基酸殘基構成的線性表位，而基于蛋白質的三級結構來預測構象表位的方法比較少，這是因為各種抗原的構象表位可獲得的數據要遠遠少于線性表位，并且到目前為止，幾乎沒有哪個抗原的所有的表位都能夠徹底的研究清楚(HasteAndersen P et al.,2006)。基于蛋白質三級結構來預測構象表位的方法CEP(Kulkarni-Kale U et al.,2005)(Conformational Epitope Prediction)：這是第一個以抗原蛋白的三級結構PDB文件作為輸入條件，以構象性表位預測為主要目的的網上免費服務軟件。它提供了一個預測構象表位的web界面，這種方法除了能夠預測構象表位，同時也能預測線性表位。它主要根據氨基酸殘基的溶劑可及性及空間距離截值來預測表位，其公布的預測精度達75%。DiscoTope(Haste Andersen P et al.,2006)：是通過蛋白質三級結構數據來預測構象表位的一種新方法，這種方法通過對X射線晶體衍射確定的76個抗原抗體復合物所組成的構象表位數據集進行大量統(tǒng)計度量、空間特征分析和表面可及性計算，對B細胞構象性表位進行預測，最終對組成蛋白序列的每個氨基酸打分，通過分值來反映某一氨基酸成為表位的可能性，并提供了閾值來確定組成表位的氨基酸殘基。預測蛋白質與蛋白質相互作用位點的方法除以上兩種方法之外，還有最近發(fā)展起來的一些預測蛋白質與蛋白質相互作用位點的方法。 由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質與蛋白質之間相互作用中的一種，因此，可以參這些方法來預測B細胞表位。分子對接：主要用來研究分子間的相互作用與識別，進而預測復合物結構。常用的分子對接軟件有ZDOCK(Chen R et al.,2003)、DOT(Shoichet BK et al.,1991)、DOCK(Mandell JG et al.,2001)、ClusPro(Comeau SR et al.,2004)等。其中ClusPro是一個提供網上服務的分子對接軟件，其能夠根據形狀互補快速的篩選ZDOCK和DOT程序產生的對接結果，并對對接結果聚類，根據聚類情況對對接結果打分，最終返回10個得分最高的對接結果，再根據這些對接結果來確定蛋白質相互作用的位點。PPI-Pred(Bradford JR et al.,2005)(protein-protein interface prediction)將支持向量機的方法同曲面分析結合在一起預測蛋白質相互作用位點。ProMate(Neuvirth H et al.,2004)(Predicting the location of potential protein-protein binding sitesfor unbound proteins)是將一些蛋白質相互作用界面的重要性質綜合起來預測蛋白質相互作用位點。這些性質包括：結合位點通常偏向位于β片層及非結構的鏈；芳香族氨基酸的側鏈常會參與蛋白質與蛋白質的相互作用；疏水氨基酸和極性氨基酸常聚集在蛋白質與蛋白質相互作用的界面；以及在晶體結構中結合位點的周圍有更多的水分子與之結合。Ponomarenko和Bourne采用以上幾種方法預測構象表位并使用同一評估體系對其進行了比較，結果表明，這些方法的準確性均未超過40%，如果用ROC(Relative operating characteristic)曲線下面積的值來評估這些方法，則DiscoTope，和PPI-PRED的值大約是0.6，ClusPro的值高于0.65，但未超過0.7，而其它的方法接近于隨機預測。盡管這些年來B細胞表位預測的方法得到了一定的發(fā)展和應用，但這些研究方法還存在一定的問題。首先，所有預測表位的方法都缺乏標準的ROC(Swets JAet al.,1988)評估，這使得各種預測方法的結果難以比較與評估；其次，大多數預測線性表位的方法都具有一定的局限性，它們僅僅是根據少數的幾個表位的特征（氨基酸的性質，殘基的表面可及性，空間分布，分子間接觸）來預測表位，而最近對各種線性表位預測方法進行評估的結果表明，僅根據氨基酸的性質來預 測線性表位的方法并不可靠。要想提高預測的準確性，需將更多表位區(qū)別于非表位的特征結合起來預測；最后，目前預測表位的方法大多數是針對于線性表位的，而據研究表明(Barlow DJ etal.,1986)90%以上的表位為構象表位，因此在進一步完善線性B細胞表位預測研究的基礎上，從蛋白質的三級結構入手，深入對構象性B細胞表位預測算法與程序的研究。同時，我們也相信隨著PDB數據庫中抗原抗體復合物的增加，能夠對各種抗原的構象表位進行更廣泛的分析，人們對蛋白質抗原表位的研究將更加透徹。 以上都是前輩們總結的，我只是借平臺和同我一樣迷茫的人們一起分享，希望有助于解決問題。但有一點，大多數軟件預測得到的是線性表位，需要構像表位，最好結合噬菌體肽庫篩選。 |
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