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段丹新蟲 (初入文壇)
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[交流]
q RT-PCR
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| 有做熒光定量pcr 的，用的是熒光染料sybr green 法， 在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，按十倍的稀釋梯度稀釋了8個(gè)，最后三個(gè)值退火溫度小于80，我跑電泳，最后三個(gè)啥也沒(méi)有，連二聚體的影子都沒(méi)有，這是什么原因呢，怎么改進(jìn)呢？ |
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冷雁孤旅
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
段丹: 金幣+1, 嗯，很具體！ 2014-12-10 18:52:38
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
段丹: 金幣+1, 嗯，很具體！ 2014-12-10 18:52:38
| 3樓說(shuō)的是對(duì)的，你可以這樣做，先做一個(gè)原始樣本的的CT值，根據(jù)你原始樣本的CT值，在決定你的稀釋倍數(shù)，對(duì)于如何確定稀釋倍數(shù)，你可以通過(guò)你的擴(kuò)增曲線或者CT值來(lái)決定，1.CT值大于30 建議減少稀釋倍數(shù)（你做8個(gè)梯度 太多了 建議做5個(gè)梯度）2.在擴(kuò)增曲線上來(lái)看的話 稀釋相同倍數(shù)的話 曲線的間隔一般是相同的 如果樣本濃度太低還驚醒稀釋的話 其擴(kuò)增曲線的間隔是不一致的。至于最后三個(gè)的退火溫度小于80°，分析是因?yàn)?CDNA模板濃度太低 導(dǎo)致QPCR擴(kuò)增結(jié)果幾乎沒(méi)有，而形成的引物二聚（你電泳跑膠二聚體 沒(méi)有 也只能說(shuō)明二聚體濃度太低 膠上沒(méi)有 但是QPCR儀器很靈敏 微量也能檢測(cè)出來(lái)） 希望對(duì)你有用 手打不容易 |
4樓2014-12-02 17:01:32
董博士
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2樓2014-12-02 15:45:58
bbqlhb
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3樓2014-12-02 16:03:08
段丹
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5樓2014-12-10 18:52:15
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