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小小肥貓新蟲(chóng) (小有名氣)
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關(guān)于胰島素體內(nèi)樣品處理方法 已有2人參與
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以下是我在文獻(xiàn)中看到的胰島素體內(nèi)樣品處理方法： A volume of 10ml of plasma sample was pipetted into a 5-ml test tube and diluted to 1 ml with PBS (pH 7.4) to permit sample to be analyzed under the sample conditions. The sample was extracted with 1ml dichloromethane by rotating for 5 min. The tube was centrifuged briefly to separate the layers and then immersed in dry-ice bath. The supernatant layer was decanted and 0.8 ml of the organic phase was transferred toanother tube. To the organic extract 130ml of 0.05 N HCl was added for back-extraction. After shaking and centrifugation the organic layer was evaporated under a stream of nitrogen and a 100-ml aliquot was injected into the HPLC. 取10μl血漿樣品加入到5mlEP管中，再加入1mlPBS（7.4），加入1ml二氯甲烷萃取，渦旋5min，簡(jiǎn)單的離心分層，置于干冰浴中，除去上清液，取0.8ml有機(jī)層轉(zhuǎn)移至另一EP管，加入130μl 0.05N HCl反萃取有機(jī)層，渦旋和離心后，有機(jī)層在氮?dú)饬飨麓蹈�，�?00μl等分樣品進(jìn)樣。 問(wèn)題：1.在該處理方法中，加入7.4PBS、二氯甲烷、0.05HCL的作用分別是什么？ 2.這樣提取分離的原理是什么？是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)嗎還是其他什么？ 3.這樣的提取分離方法能將胰島素與血漿蛋白分離開(kāi)嗎？ 4.是直接吹有機(jī)層嗎？吹的程度怎么掌握？ 請(qǐng)各位大神給予指點(diǎn)�。�！ |
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yuecen
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親，你真的是很有科研精神啊，180個(gè)贊：） 這個(gè)是太久遠(yuǎn)的生物化學(xué)的內(nèi)容啦。胰島素是小分子蛋白其等電點(diǎn)在5.34-5.45之間，呈弱酸性，PH7.4的磷酸鹽緩沖液呈弱堿性，此時(shí)不足以使胰島素的羧基與其提供的正離子成鹽，所以胰島素主要以分子狀態(tài)存在。非極性的物質(zhì)在含水的極性環(huán)境中存在中時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種相互聚集的力，疏水鍵或疏水作用力，促使胰島素分子進(jìn)入二氯甲烷中。0.05MHCL的PH值應(yīng)該是在3左右吧，加入強(qiáng)酸使胰島素分子中氨基的部分與其成鹽，胰島素分子呈離子狀態(tài)，與二氯甲烷分離進(jìn)入水相。有機(jī)層在氮?dú)饬飨麓蹈晒烙?jì)是考慮其收率，你可以試試不吹干和吹干有多大區(qū)別。之所以選擇等電點(diǎn)附近的PH值，就是因?yàn)檫h(yuǎn)離等電點(diǎn)溶解度大，靠近等電點(diǎn)溶解度小。血漿樣品中的其他大分子蛋白質(zhì)在加入鹽之后，正如你所說(shuō)是去水化層沉淀啦，祝你好運(yùn)！ |
9樓2014-12-04 09:00:26
yuecen
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【答案】應(yīng)助回帖
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胰島素等電點(diǎn)為5.35-5.45，所以采用PH7.4的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)血漿樣品至中性，使胰島素呈分子狀態(tài)，用二氯甲烷萃取，再用0.05HCL反提至水相。個(gè)人認(rèn)為應(yīng)該能分開(kāi)，不妨試試，至于有機(jī)層要盡量吹干，那個(gè)沸點(diǎn)低好吹干，因?yàn)橐M(jìn)樣的是水相。吹的程度只要不把溶液吹出來(lái)就行了，水相是很難吹干的，所以不用擔(dān)心啦 |
2樓2014-12-02 23:12:26
3樓2014-12-03 14:36:19
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4樓2014-12-03 21:24:50
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5樓2014-12-03 21:27:07
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液相的話(huà)檢測(cè)精度是不夠的，至少是液質(zhì)，而且普通質(zhì)譜不行，一般四級(jí)桿質(zhì)譜分質(zhì)量只能到3000，得用傅里葉質(zhì)譜了。我們以前做過(guò)，提取回收率最高也就能到40%，目前基本上所有胰島素申報(bào)項(xiàng)目的血藥胰島素濃度都是Elisa測(cè)定的，其實(shí)Elisa試劑盒沒(méi)有你所想那么貴，你查一查文獻(xiàn)或者是各胰島素藥品的審評(píng)綜述，基本都是Elisa，當(dāng)然也有使用液質(zhì)測(cè)定的，但是很難重復(fù)出來(lái)，提取回收率都不高，誤差比較大 |
6樓2014-12-04 08:27:55
7樓2014-12-04 08:32:14
8樓2014-12-04 08:39:54
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10樓2014-12-04 09:02:12
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