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細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制具體步驟與消毒方法 已有1人參與
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實(shí)驗(yàn)器材與生物試劑 干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶 ，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平 、PH計(jì) 、磁力攪拌器 。 具體步驟 一. 水的制備 細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制) 1.溶解定容：將藥品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶 中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。 2.移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi)，蓋上膠，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)120℃消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾 水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。 三. 胰蛋白酶 溶液的配制與消毒 胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清 、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的 BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清 培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。 1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25%，用電子天平 準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯 中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調(diào)PH到 7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。 2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。 四.青、鏈霉素溶液的配制與消毒 1. 所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。 2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位 /瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。 3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為 100單位/ml。1單位=1微克 五.RPMI1640的制備與消毒： 1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將微生物培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入微生物培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向微生物培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。 2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。 3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。 4.分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。 5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃時(shí)兩周有效)。 |
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2樓2015-01-29 18:49:36
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