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基因組光學(xué)圖譜技術(shù)于微生物完整基因組測定中的Gap closure 應(yīng)用
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基因組光學(xué)圖譜技術(shù)是一種利用單分子DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜生成高分辨率、有序的全基因組限制性內(nèi)切酶酶切圖譜的方法. 2010 年，OpGen 公司面向市場推出了基于光學(xué)圖譜專利技術(shù)的自動化的基因組拼接和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)——Argus™工作站，使研究人員能夠在一個(gè)工作日內(nèi)獲得待測微生物基因組的高質(zhì)量全基因組限制性內(nèi)切酶酶切圖譜。該系統(tǒng)主要由Mapcard 加工工作站、光學(xué)掃描系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理工作站等組成，通過限制性內(nèi)切酶對固定于MapCardDNA surface 區(qū)域中的單分子DNA 進(jìn)行原位切割，使切割后的DNA 片段順序保持不變。DNA 片段經(jīng)熒光染料染色后置于熒光顯微鏡下，采集每個(gè)限制性內(nèi)切酶片段的大小和順序的信息，信息經(jīng)轉(zhuǎn)換處理后生成單個(gè)DNA 分子的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜，最后根據(jù)全部DNA 分子限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜的相互重疊部分拼接得到全基因組限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜。該系統(tǒng)最初被應(yīng)用于微生物基因組序列組裝、比較基因組學(xué)以及菌株分類，目前已經(jīng)開始在人類和動植物全基因組組裝中應(yīng)用。 作為對基因組454-Sanger 雜交測序法的一種新的替代技術(shù)，光學(xué)圖譜技術(shù)提供了一種全新的微生物基因組測序和拼接策略，雖然該技術(shù)不能直接獲得基因組DNA 的堿基序列，但它可以提供微生物基因組整體有序的物理框架結(jié)構(gòu)。通過與新一代測序技術(shù)的結(jié)合，光學(xué)圖譜技術(shù)可以提供基因組絕大多數(shù)Contig 的位置和順序信息，從而輔助基因組的Scaffold 構(gòu)建，在復(fù)雜微生物基因組(多重復(fù)序列)的Gap closure 中已經(jīng)被證明行之有效。 如在嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)基因組的Gap closure 過程中，由于含有多達(dá)幾百個(gè)轉(zhuǎn)座子序列以及7 套核糖體RNA 序列(16-23-5S)，導(dǎo)致經(jīng)過4 個(gè)月的拼接后還剩余36 個(gè)Contig 無法找到Linkage 關(guān)系完成拼接，借助于光學(xué)圖譜技術(shù)研究人員通過將嗜線蟲致病桿菌高質(zhì)量的基因組酶切物理圖譜(基因組限制性內(nèi)切酶酶切圖譜)與基因組序列模擬酶切圖譜(根據(jù)測序序列信息計(jì)算機(jī)模擬所生成基因組In silico 酶切圖譜)進(jìn)行比較，最終將36 個(gè)Contig 定位，并且通過比較圖譜之間的差異還發(fā)現(xiàn)幾處由于新一代測序技術(shù)自身缺陷(讀長短、堿基插入和缺失)所造成的Contig 本身拼接錯(cuò)誤，經(jīng)過糾正，在一個(gè)月內(nèi)完成了嗜線蟲致病桿菌基因組的Gap closure。 除了基因組序列模擬的酶切圖譜，Argus™系統(tǒng)還可以整合其它一些序列的酶切物理圖譜信息( 文庫克隆序列、Gap closure PCR 產(chǎn)物以及Paired-End 序列等)用于輔助微生物基因組的Gap closure 工作。 技術(shù)流程 DNA樣品制備 參考文獻(xiàn) [1] Schwartz DC, Li X, Hernandez LI, et al. Ordered restriction maps of Saccharomyces cerevisiae chromosomes constructed by optical mapping[J]. Science, 1993, 262(5130): 110-114. [2] Levy-Sakin M, Ebenstein Y. Beyond sequencing: optical mapping of DNA in the age of nanotechnology and nanoscopy[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2013, 24(4): 690-698. DOI: 10.1016/j.copbio.2013.01.009. [3] Nagarajan N, Cook C, Di Bonaventura M, et al. Finishing genomes with limited resources: lessons from an ensemble of microbial genomes[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 242.DOI:10.1186/1471-2164-11-242. [4]Zhou S, Kile A, Bechner M, et al. Single-molecule approach to bacterial genomic comparisons via optical mapping[J]. Journal of Bacteriology, 2004, 186(22): 7773-7782. [5] Zhou S, Kile A, Kvikstad E, et al. Shotgun optical mapping of the entire Leishmania major Friedlin genome[J].Molecular and Biochemical Parasitology, 2004, 138(1): 97-106 [6] Latreille P, Norton S, Goldman BS, et al. Optical mapping as a routine tool for bacterial genome sequence finishing[J].BMC Genomics, 2007, 8: 321. DOI: 10.1186/1471-2164-8-321. [7] Nagarajan N, Read TD, Pop M. Scaffolding and validation of bacterial genome assemblies using optical restriction maps[J]. Bioinformatics, 2008, 24(10): 1229-1235. [8] Turner PC, Yomano LP, Jarboe LR, et al. Optical mapping and sequencing of the Escherichia coli KO11 genome reveal extensive chromosomal rearrangements, and multiple tandem copies of the Zymomonas mobilis pdc and adhB genes[J]. Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology, 2011, 39(4): 629-639. [9] Skiadas J, Aston C, Samad A, et al. Optical PCR: genomic analysis by long-range PCR and optical mapping[J].Mammalian Genome, 1999, 10(10): 1005-1009. 【10】尤曉顏,張彬,鄭華軍,姜成英.微生物完整基因組測定中的Gap closure策略[J].微生物學(xué)通報(bào),2014,41(5):924~933 |
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wenzi6337
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2樓2015-01-18 13:31:49
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