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xewangjie2004銀蟲 (小有名氣)
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RNA抽提細節(jié)技巧小總結
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對大部分實驗人員來說，RNA抽提比基因組DNA抽提要困難得多。事實上，現(xiàn)有的RNA抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細胞中抽提RNA，比抽提基因組DNA更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織RNA的抽提，總會碰到問題呢？ 組織RNA抽提失敗的兩大現(xiàn)象是：RNA 降解和組織內(nèi)雜質的殘留。關于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細胞中抽提RNA不容易降解�，F(xiàn)有的RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase 的成分。在培養(yǎng)細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內(nèi)的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其RNA不容易被降解；反過來講，組織中的RNA之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制Rnase活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內(nèi)的Rnase降解RNA的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎100%能獲得解決。影響后續(xù)實驗的雜質殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應也不同�？傊�，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質殘留現(xiàn)象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白質——嘴用來碾磨，腸胃用來抽提。 究竟怎樣才能確保RNA抽提的成功率呢？實驗前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步。好的方法/試劑在確保成功的同時，操作方便，經(jīng)濟實用。當然，您的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實驗失敗的原因，以便改進。 實驗前方法/試劑的選擇 0：抽提 RNA的目的 RNA用于不同的后續(xù)實驗，其質量要求不盡相同。cDNA文庫構建要求RNA完整而無酶反應抑制物殘留；Northern對RNA完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RT-PCR對RNA完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。投入決定產(chǎn)出，每次都以獲得最高純度的RNA為目的，勞民傷財。 1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素 樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關。傳統(tǒng)上，只有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織、肝臟、胸腺、胰腺、脾臟、腦、脂肪、肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。 2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素 樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使RNA徹底完整地釋放出來。細胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細菌需要先用相應的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織、肝臟、胸腺、胰腺、脾臟、腦、脂肪、肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點：在整個碾磨過程中，樣品不能融化，因為冷凍后內(nèi)源酶更容易起作用。 3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質殘留的因素 常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結合純化方法一起考慮。只有一個例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。 4：純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質殘留，抽提速度的因素 對于干凈的樣品，如細胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結果。但對于許多其它樣品，尤其是植物、肝臟、細菌等雜質含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應的雜質，但價格較貴；使用經(jīng)濟而經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，也可以獲得滿意的結果，但操作時間長。 RNA 抽提的“三大紀律八項注意” 紀律一：杜絕外源酶的污染。 注意一：嚴格戴好口罩，手套。 注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。 注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。 紀律二：阻止內(nèi)源酶的活性 注意四：選擇合適的勻漿方法。 注意五：選擇合適的裂解液。 注意六：控制好樣品的起始量。 紀律三：明確自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。 注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟的標準是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。 RNase 污染的10大來源 1：手指頭 – 手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因為呼吸也是一個重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護實驗人員。 2：槍頭，離心管，移液器 單純的滅菌是不能滅活RNase的，所以槍頭和離心管要用DEPC處理，即使是標明為DEPC處理過的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。 3：水/緩沖液 一定要確保無RNase污染。 4：實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。 5：內(nèi)源 Rnase 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。 6：RNA 樣品 RNA抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的RNase污染。 7：質粒抽提 質粒抽提往往用到RNase降解RNA，殘留的RNase要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。 8：RNA 保存 即使低溫保存，痕量的RNase亦會導致RNA降解。長期保存RNA的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。 9：陽離子 (Ca, Mg) 在含這些離子時，80℃加熱5分鐘會導致RNA被剪切，故如果RNA需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。 10：后續(xù)實驗所用的酶 酶均有可能被Rnase污染。 RNase 和 DEPC 處理 1：高壓滅菌是可以滅活部分RNase A 的。實驗證明：37℃與RNA反應，沒有滅菌的PBS活性點為100 pg/ml，滅菌后的活性點為100ng/ml。當然，滅菌后RNase 仍然不能認為沒有殘留。 2：DEPC在水中半衰期為30分鐘。經(jīng)15分鐘滅菌后可以認為徹底破壞了0.1%DEPC中的DEPC，破壞后可以聞到一點氣味。 3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分別加入1ug/ml Rnase A和0.1%及1%DEPC。實驗結果提示，0.1% DEPC只對MOPS有效，而1% DEPC對三種試劑都有效。 4：0.01%DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC有效去除的RNase A的濃度分別為：100ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 滅活后的副產(chǎn)品，對有些后續(xù)實驗是有影響的。 RNA 抽提的10大竅門 1：快速阻止Rnase活性樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活Rnase。 2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。 3：預判質量要求Northern，cDNA文庫構建對完整性要求高，RT-PCR,RPA(Ribonuclease protection assay) 對完整性要求不是很高。RT-PCR對純度(酶抑制物殘留)要求很高。 4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關鍵。 5：檢查 RNA 的完整性 電泳檢測，28S:18S =2:1是完整的標志，1:1對大部分實驗也是可以接受的。 6：去除 DNA 用于 RT-PCR, array analysis 最好用Dnase I去除DNA。 7：降低外源酶的污染 不能從外面又導入酶。 8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。 9：徹底溶解 RNA，必要時可以65℃加熱5分鐘。 10：合適的保存方法 – 短時間可以–20℃保存，長期請保存于–80℃。 提高 RNA 得率 首先要意識到不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟、胰腺、心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦、胚胎、腎臟、肺、胸腺、卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱、骨、脂肪。 1：裂解細胞使RNA釋放出來，RNA如果不被釋放出來，得率是會降低的。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase) 。 2：抽提方法的優(yōu)化�；诒椒拥姆椒ǖ淖畲髥栴}是分層不徹底和部分RNA的丟失(不能全部將上清取出)。分層不徹底是因為核酸和蛋白質含量高，可以用增加裂解液用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA的丟失可以用反抽方法或者去除有機層后再離心的方法降低。基于柱離心式方法的最大問題是樣品過量。 經(jīng)典抽提小技巧 1：Phenol純化：將等體積的Phenol/Chloroform（1:1）加入，劇烈混勻1-2 分鐘，高速離心2分鐘，小心取上清(80-90%)，絕不能取到中間層�？梢允褂玫润w積的反應液加入 Phenol/Chloroform 中，同樣再取出上清。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混勻時不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。 2：70-80% 乙醇洗滌：洗滌時，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去。同時，在倒掉乙醇后，立即高速離心數(shù)秒，再用移液器去除殘留的乙醇。室溫靜置 5-10分鐘后，溶解。 特殊組織的抽提 纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提RNA關鍵在徹底破碎組織。這些組織細胞密度低，故單位重量的組織RNA的含量就少，最好用盡可能多的起始量。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。 蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI抽提后，上清含白色絮狀物，必須用氯仿再次對上清進行抽提。 核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠 (因為核酸含量高的緣故)，PCI抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。多次PCI抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有DNA污染。溶解后用酸性PCI再次抽提，可以去除DNA污染。 植物組織：植物組織比動物組織更為復雜。一般，大家都是在液氮條件下對植物進行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象不常見。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質導致。許多植物的內(nèi)含雜質都會殘留，之所以殘留，往往是因為這些雜質與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點決定了它們是非常強的酶抑制劑。目前，商品化的RNA抽提試劑經(jīng)過調(diào)整大部分可以適合幾乎所有的動物組織，適合大部分植物組織RNA抽提試劑相對少一些。 樣品凍融的影響 冷凍的樣品可能較大，用于抽提RNA之前，需要切割。切割過程中樣品往往出現(xiàn)融化。冷凍的樣品抽提RNA前可能還要稱重，這個過程肯定會出現(xiàn)融化。有時候，液氮碾磨過程中也會出現(xiàn)樣品的融化；或者冷凍樣品不經(jīng)過液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會出現(xiàn)融化。實驗表明，冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發(fā)生RNA的降解�？赡艿脑蚴牵簝鋈谶^程破壞了細胞內(nèi)的結構，使內(nèi)源酶更容易與RNA直接接觸。 RNA質量的判斷 通常，使用電泳判斷RNA的完整性，使用A260/A280 判斷RNA的純度。理論上，完整的 RNA 擁有28S:18S = 2.7:1 的比例，大部分資料則強調(diào) 28S:18S = 2:1 的比例。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的RNA幾乎都得不到2:1 的比例(此結論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得)。RNA的電泳結果受許多因素的影響，包括二級結構、電泳條件、上樣量、被EB飽和的程度等。使用非變性電泳檢測RNA，以DNA Marker做對照，如果2kb處的28S和0.9kb處的18S條帶清晰，且28S:18S > 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗要求了。A260/A280是一個給大家?guī)碓S多困惑的指標。首先要明確該指標用于核酸的原始含義是：純的RNA，其A260/280 = 2.0 左右。純RNA是‘因’，A260/A280 = 2是‘果’�，F(xiàn)在大家卻在拿A260/A280當‘因’用，認為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在您的RNA樣品中加入一點抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚、異硫氰酸胍、PEG 等，再測A260/A280比值。現(xiàn)實是，許多抽提RNA時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質都在A260和A280處附近有吸收，對 A260/A280產(chǎn)生影響。目前最具有指導性的做法是：對RNA樣品在200-300 nm范圍掃描。純 RNA的曲線具有如下特點：曲線平滑，A230和A260是兩個拐點，A300接近0，A260/A280 = 2.0左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果沒有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測定A260/A230 比值，因為該比值對所有影響酶反應的雜質的殘留更敏感。要考慮設備的線形范圍 (A260 要處于 0.1 – 0.5 之間)。另外有兩個有用的現(xiàn)象：在水中測定 A260/A280，比值將變低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中測定的比值比在 1mM EDTA 中測定的高 0.2 左右。 |
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