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289363400鐵桿木蟲 (知名作家)
凌亂前進方向
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[求助]
急切求助，ELISA空白孔顯色 已有4人參與
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前段時間一直沒有問題的，OD450在0.1以下，最近不知道怎么了，空白孔的顏色一直非常明顯，幾乎與陽性孔沒有分別。 我以100微升PBS加100微升包被緩沖液（0.1 M NaCO3，pH 9.6）在4℃過夜包被。 第二天加封閉液，37℃，2h。 加入HRP標記的抗體，37℃，1h。 加入TMB底物緩沖液，結(jié)果顏色非常明顯。 我分析過可能的影響因素，比如： 1.封閉液試過5%脫脂奶粉、1%BSA; 2.HRP標記的抗體的濃度嘗試過1:5000，1:10000和1:15000； 3.實驗用的PBS和PBST重新配置； 4.嘗試不去過夜包被，而直接從封閉開始； 以上實驗的結(jié)果全部為空白孔顯色！這些實驗基本排除了封閉液、包被液、PBS、PBST的問題。 我也嘗試過直接向酶標孔中加入顯色液，結(jié)果是沒有顏色的，這也就排除了顯色液的問題。 最后我懷疑可能是抗體的問題，但是抗體能有什么問題啊？ 求救！ |
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sunshine436
新蟲 (小有名氣)
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2樓2015-01-16 09:54:35
【答案】應(yīng)助回帖
商家已經(jīng)主動聲明此回帖可能含有宣傳內(nèi)容
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
289363400: 金幣+2, ★有幫助, 謝謝！以前的孵育時間一直都是1小時，空白孔也沒有明顯顯色�，F(xiàn)在的洗滌條件已經(jīng)改為5次，前三次PBST，后兩次PBS，應(yīng)該是沒有問題了吧。現(xiàn)在初步懷疑是我每次吸取抗體原液時在槍頭上沾染過多，使得抗體濃度配制不準確。 2015-01-17 09:06:44
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
289363400: 金幣+2, ★有幫助, 謝謝！以前的孵育時間一直都是1小時，空白孔也沒有明顯顯色�，F(xiàn)在的洗滌條件已經(jīng)改為5次，前三次PBST，后兩次PBS，應(yīng)該是沒有問題了吧。現(xiàn)在初步懷疑是我每次吸取抗體原液時在槍頭上沾染過多，使得抗體濃度配制不準確。 2015-01-17 09:06:44
| 縮短二抗時間試試。還有非特異吸附的話，增加洗滌條件，降低二抗?jié)舛�，洗滌徹不徹底�? |
3樓2015-01-16 16:53:07
hbl215
金蟲 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
289363400: 金幣+5, ★★★很有幫助, 關(guān)于紙的影響，學(xué)習了。現(xiàn)在問題似乎出在吸取抗體原液時槍頭沾染過多，使得配制的抗體濃度不準。 2015-01-17 09:08:26
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
289363400: 金幣+5, ★★★很有幫助, 關(guān)于紙的影響，學(xué)習了。現(xiàn)在問題似乎出在吸取抗體原液時槍頭沾染過多，使得配制的抗體濃度不準。 2015-01-17 09:08:26
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1.封閉用2%bsa。 2.二抗孵育半小時就夠了，多了反而背景高。 3.二抗孵育結(jié)束的洗板很重要，這一步的洗滌一定要干凈。包括放置太久長菌的pbst殘留液都會引起假陽性。 4.機洗，手洗？手洗拍板，墊的紙臟的話也有影響的，特別是如果紙屑多還含熒光劑。 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
4樓2015-01-16 21:32:41
5樓2015-01-17 10:06:54
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