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billtsu

木蟲 (正式寫手)

木木

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LZ,你的陽性對照沒有�。∵@個優(yōu)先考慮解決

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啊木

21樓2015-01-28 17:37:41

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wandinerrisa

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專業(yè): 口腔頜面疾病其他科學(xué)問題

【答案】應(yīng)助回帖

轉(zhuǎn)膜時(shí)間太短了吧，我們一般用濕轉(zhuǎn)200mA，2h

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22樓2015-01-30 00:07:26

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qwbio123

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【答案】應(yīng)助回帖

mark也看不清楚，條帶能看出有來，感覺就像粘在一起了，是不是電泳時(shí)間不夠啊，因?yàn)檫@個影響因素較多，你需要一個一個排除。
Western Blot常見問題分析這是個技術(shù)貼希望對你分析實(shí)驗(yàn)有幫助http://www.bioconsumable.com/cn/tech/2012/4-23/tech_62582186.htm

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23樓2015-01-30 14:09:27

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HaiGene

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【答案】應(yīng)助回帖

從加倍后的圖看是可以雜出目的條帶的，現(xiàn)在有兩個問題1.泳道有拖帶背景，2.雜交條帶連在一起且?guī)筒灰?guī)則。

這種問題主要是蛋白提取的不好，可用超強(qiáng)RIPA提取，另外泳道有背景和條帶連在一起是因?yàn)闆]有去除蛋白中的DNA，建議在提取蛋白時(shí)加入Benzonase核酸酶消化dna。另外，制膠時(shí)務(wù)必使各組分混合均勻后灌膠。

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24樓2015-03-04 14:12:02

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曼舞流蘇

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【答案】應(yīng)助回帖

轉(zhuǎn)膜也是恒壓？LZ你洗膜時(shí)間也太長了吧，1h有點(diǎn)長，會不會把蛋白都搖洗掉了。。。

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25樓2015-05-15 09:53:06

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zmxwfd

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【答案】應(yīng)助回帖

15V，30min半干轉(zhuǎn)時(shí)間是不是有問題？你們實(shí)驗(yàn)室有人做過這個大小的轉(zhuǎn)膜么？問下你們實(shí)驗(yàn)室的同事，確認(rèn)沒問題在做下一步
試試ECL顯色孵育1min，會不會曝光過度？
我覺得你轉(zhuǎn)膜有問題，我們半干轉(zhuǎn)一般都是7min

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26樓2015-05-15 20:31:03

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siriusxuan

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【答案】應(yīng)助回帖

為什么掃出來的圖這么難看
條帶拖尾蛋白沒有裂解開，或者不溶的蛋白太多，如果是冰凍樣品可以再沸水浴一下，然后簡短離心取上清跑電泳，提蛋白時(shí)候超聲幾下也有好處。在確認(rèn)下實(shí)驗(yàn)室的SDS試劑濃度和質(zhì)量沒問題。
可以試下濕法轉(zhuǎn)膜。

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此座可言輕社稷，江山萬里起風(fēng)塵。

27樓2015-05-17 10:28:11

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siriusxuan

木蟲 (正式寫手)

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引用回帖:

25樓: Originally posted by 曼舞流蘇 at 2015-05-15 09:53:06
轉(zhuǎn)膜也是恒壓？LZ你洗膜時(shí)間也太長了吧，1h有點(diǎn)長，會不會把蛋白都搖洗掉了。。。

洗上一整天也洗不掉。。。。

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此座可言輕社稷，江山萬里起風(fēng)塵。

28樓2015-05-17 10:29:01

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mazhenggen

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專業(yè): 腫瘤生物治療

【答案】應(yīng)助回帖

做west blot 是個比較需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)，特別是蛋白表達(dá)量很低的時(shí)候。導(dǎo)致失敗的因素很多，需要逐個排除：1、確保蛋白轉(zhuǎn)膜成功，可以用預(yù)染Marker 進(jìn)行SDS-PAGE，觀察一下就知道了；2、一抗的濃度非常關(guān)鍵，多了背景太深，少了不顯色。所以用不同比列濃度的一抗進(jìn)行摸索實(shí)驗(yàn)，至少得三個梯度吧，多點(diǎn)更好。找到一抗的適合濃度之后，下次重復(fù)實(shí)驗(yàn)就愛可以用最佳的一抗?jié)舛攘恕?，確定二抗的來源是否與一抗對應(yīng)，比如兔抗鼠、鼠抗人等；4，確保顯色劑沒有問題。5，一定需要一個陽性對照，如果陽性對照沒有問題，說明實(shí)驗(yàn)操作本身沒有問題。

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我喜歡所以我做

29樓2015-05-17 10:40:15

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