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好糾結(jié)新蟲 (初入文壇)
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[求助]
請教一個western blot的問題，急需答案，謝謝！�。�！ 已有20人參與
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在做一個大小為32kDa的蛋白，是abcam的，按照計算的正常上樣量，結(jié)果如圖（已做完內(nèi)參，沒有問題）。懷疑是目的蛋白的表達(dá)量不夠，增加上樣量的結(jié)果如圖。 實驗的大致過程如下 1，電泳 60V(30min),80V（30min）,100V跑到底 2 轉(zhuǎn)膜 半干轉(zhuǎn)，15V（30min）,硝酸纖維素膜 3 封閉 37℃2h,3h,4℃過夜都試過,未發(fā)現(xiàn)太大影響（都做不出結(jié)果）。 4 一抗 4℃過夜或者37℃2h（根據(jù)封閉的時間選擇），稀釋度是按照說明書上的要求1：1000 5 洗膜 TBST 10min/次×6 6 二抗 37℃1h，稀釋度1:5000 7 洗膜 同上 8 顯影 ECL暗室處理3min（說明書要求，沒問題），照相時的時間選擇是5s,200s,50張。 抗體是用PBS稀釋（實驗室一直都是這么做的），試過用3%BSA稀釋，無變化。 小弟已經(jīng)實在想不出為什么了（快瘋），請各位師兄師姐發(fā)發(fā)慈悲給小弟直條明路吧。 正常上樣量 上樣量加倍 最大上樣量 |
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mark也看不清楚，條帶能看出有來，感覺就像粘在一起了，是不是電泳時間不夠啊，因為這個影響因素較多，你需要一個一個排除。 Western Blot常見問題分析這是個技術(shù)貼希望對你分析實驗有幫助http://www.bioconsumable.com/cn/tech/2012/4-23/tech_62582186.htm |
23樓2015-01-30 14:09:27
HaiGene 
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西門吹雪170: 應(yīng)助指數(shù)-1, 屏蔽內(nèi)容, 無應(yīng)助，字符亂碼 2015-01-26 20:10:02
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2樓2015-01-26 10:43:20
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3樓2015-01-26 12:08:14
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5樓2015-01-26 14:48:21
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