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糖泡泡金蟲 (正式寫手)
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[求助]
western blot中古怪的非特異性條帶
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最近做western blot總受一些非特異性條帶的干擾，雖查了好多資料，一一排查，還是沒有解決。想問下我的蛋白經(jīng)過反應(yīng)后是溶解在酸性溶液里（pH 4.0-6.0）,直接加入loading buffer煮沸后電泳轉(zhuǎn)膜顯色，酸性溶液中的蛋白直接western blot會是非特異性顯色的來源嗎？大家還有什么好的建議針對我的非特異性。 Ps，發(fā)現(xiàn)從背面看我的特異性條帶特別明顯，非特異性條帶不怎么清楚。但正面看膜的話特異性條帶模糊，非特異性條帶特別濃，這又是什么原因？ Help!  [ Last edited by 1949stone on 2013-7-5 at 15:59 ] |
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正面背面的問題，難道你的轉(zhuǎn)膜有穿孔現(xiàn)象？可以換張另一批次的PVDF膜再做次看看， 雜帶問題一般說來，先稀釋樣品，做個(gè)梯度，如果還有雜帶，稀釋一抗，做梯度，試試如何，再不行，投訴抗體公司，不是你的錯 |
2樓2013-06-28 19:39:56
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7樓2013-07-05 17:09:16
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8樓2013-07-06 00:40:49
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謝謝你的建議！我沒有用麗春紅染NC膜，就是將樣品上了兩份，一份跑后的膠用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察上樣量，一份直接western。我的目標(biāo)蛋白是45 k，是經(jīng)過多種修飾的。非特異性的蛋白是39 K�，F(xiàn)在遇到的情況是非特異性蛋白上樣量很少，western條帶還很深，而我的目標(biāo)條帶相反。理論上我的目的條帶比那個(gè)非特異性條帶要大，更不容易轉(zhuǎn)過，但目的條帶在背面看顯色更深，正面很淺。應(yīng)該是轉(zhuǎn)完全了，染過轉(zhuǎn)完膜后的膠，沒有東西。 可以跟您在QQ上聊嗎？有一些westernblot的問題想請教下，不知道可不可以知道你ＱＱ，非常感謝！ |
9樓2013-07-06 10:50:51
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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我沒有遇到過這種情況。因?yàn)閣estern是半定量的，應(yīng)該是蛋白量越多條帶越深。不知道你做western的目的是什么，既然目標(biāo)蛋白和非特異條帶在膠上位置不同，應(yīng)該可以區(qū)分，這種結(jié)果也算是可以接受的吧。我?guī)缀醪挥肣Q的。你可以發(fā)email給我：cicelyzhang@hotmail.com |
10樓2013-07-06 13:42:57
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