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western-blot的問題�。�！ 已有4人參與
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各位大神，你們好： 小弟最近做目的蛋白WB檢測，從植物種子中粗提蛋白，兩塊膠，一快染色，一快WB。 問題是：陽性對照有條帶，很清晰（陽性對照為純化的蛋白），而檢測的蛋白卻沒有條帶，而用ELISA檢測同樣的檢測樣品，結(jié)果呈陽性。為什么ELISA能檢測出來，而WB檢測不出來呢？ 上樣量做過梯度，轉(zhuǎn)膜電流、時間也摸索過 但是為什么會出現(xiàn)這種情況呢？還請各位大神顯靈吧，小弟拜謝了！ |
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 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
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hellokkzhu
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2樓2014-02-25 20:04:20
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5樓2014-02-28 22:10:39
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【答案】應助回帖
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一、Western Blot實驗條帶沒出現(xiàn)的原因分析及解決辦法 ： 原因分析 解決辦法 1.一抗和二抗失效 1. 更換抗體；選擇現(xiàn)用現(xiàn)配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更換為同種同屬的同亞型的抗體底物 3.發(fā)光液失效 3. 更換新的發(fā)光液 4.抗體染色不充分 4. 增加抗體濃度；延長孵育時間 5.被測樣品中不含有目的蛋白質(zhì)或者目的 蛋白質(zhì)含量太低 5. 設置陽性對照。確定標本中是否含有目的蛋白質(zhì)； 增加樣品 的上樣量。 6. 溶液中有辣根過氧化物酶的抑制劑 6.用透析和超濾除去所用溶液中如疊氮化鈉之類的抑制劑 7.抗體活力降低 7.在抗體活力保存時間內(nèi)使用抗體；工作液現(xiàn)用現(xiàn)配 二、一抗與二抗的專一性識別檢測，就是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用檢測，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量轉(zhuǎn)移、分子篩層析等。 |
6樓2014-07-12 00:52:20
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