 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 6849 | 回復: 22 | |||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 BioEPI ，點擊這里進行查看 | |||||
qiang7金蟲 (小有名氣)
|
[求助]
Western Blot電泳蛋白質外漏問題求助
|
||||
|
求助各位高手指點，本人最近蛋白電泳過程中經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白樣品剛跑離樣品孔還沒進入分離膠的時候，樣品就漏下來了！如下圖所示。在我想的問題都找遍了，比如濃縮膠濃縮時間，玻璃板清洗問題及玻璃板都換新的了，還有試劑都換了一套，還是漏 真不知道還有什么致命因素沒有找到，請各位大俠指點！小弟將不勝感激！ |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 蛋白質生物學實驗經(jīng)驗 | 核酸生物學實驗經(jīng)驗 | 蛋白電泳 漏樣 |
» 猜你喜歡
求調劑
已經(jīng)有3人回復
-
265求調劑
已經(jīng)有4人回復
-
085700資源與環(huán)境308求調劑
已經(jīng)有6人回復
-
一志愿吉林大學材料學碩321求調劑
已經(jīng)有12人回復
-
286分人工智能專業(yè)請求調劑愿意跨考！
已經(jīng)有3人回復
-
329求調劑
已經(jīng)有5人回復
-
申請回稿延期一個月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時間沒變，給編輯又寫郵件了，沒回復
已經(jīng)有4人回復
-
材料學碩318求調劑
已經(jīng)有5人回復
-
一志愿中國海洋大學，生物學，301分，求調劑
已經(jīng)有6人回復
-
081700化工學碩調劑
已經(jīng)有3人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 求助，Western-Blot轉膜不成功
已經(jīng)有22人回復
- western blot中蛋白質轉印問題
已經(jīng)有17人回復
- western blot 求助，請高手指點一下
已經(jīng)有8人回復
- western blot時marker問題求助
已經(jīng)有18人回復
- 【求助】WB過程中跑電泳時，蛋白質外漏
已經(jīng)有5人回復
- 【求助/交流】western膠電泳完為什么會裂
已經(jīng)有4人回復
- 【求助/交流】有關western-blot的一些問題
已經(jīng)有18人回復
- 【求助/交流】求教電泳的基本問題
已經(jīng)有5人回復
- Western Blot 磷酸化蛋白測定問題
已經(jīng)有9人回復
雪山飛狐7233
鐵桿木蟲 (著名寫手)
鐵桿小蟲
- BioEPI: 9
- 應助: 10 (幼兒園)
- 金幣: 18826.4
- 散金: 209
- 紅花: 44
- 帖子: 1530
- 在線: 199.1小時
- 蟲號: 593313
- 注冊: 2008-09-05
- 性別: GG
- 專業(yè): 化學計量學與化學信息學
【答案】應助回帖
qiang7(金幣+5): 謝謝您的熱心，我再細細的查找一遍 2011-05-22 15:19:27
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35
|
肯定是你液體配制中的問題，這是我的配方，可以參考一下。 1. 試劑配制 1.1母液 1.1.1 1.0mol/L Tris•HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸餾水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl 7.4 約17ml 7.5 約16m 7.6 約15ml 8.0 約10ml 1.1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 異丙醇 100ml 溶解后，分裝于1.5ml離心管中，-20℃保存。 1.1.3 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸餾水至 500ml 溶解后，高壓滅菌，室溫保存。 1.1.4 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO •12H2O（MW 358.14） 71.6g 蒸餾水至 1000ml 溶解后，高壓滅菌，室溫保存。 1.1.5 10％SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml 50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 1.1.6 10％過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g 超純水 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存時間為1周。 （可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中，一次性多裝幾管，使用時加入超純水即可） 1.1.7 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超純水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。 1.1.8 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超純水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。 1.1.9 40％Acr/Bic（37.5:1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g 甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g 超純水至 100ml 溶解后4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。 1.1.10 30％Acr/Bic（29:1） 丙稀酰胺（Acr） 29g 甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g 超純水至 100ml 溶解后4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。 1.1.11 20％Tween20 Tween20 20ml 蒸餾水至 100ml 混勻后4℃保存。 1.2 使用液配制 1.2.1 單去污劑裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris•HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml 蒸餾水至 50ml 混勻后4℃保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 一般實際用的比較多的其實是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方： 50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS。 裂解得到的蛋白樣品，由于含有較高的蛋白去垢劑干擾，不能用Brandford法測定蛋白濃度,要用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。 RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強度大致可以分為強、中、弱三類。對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強、中或弱)。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強度過強，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 對于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強、中)或SDS裂解液。 1.2.2 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO4 81ml NaCl 17g 蒸餾水至 2000ml 1.2.3 G250考馬斯亮藍溶液（蛋白定量專用） 考馬斯亮藍G250 100mg 95％乙醇 50ml 磷酸 100ml 蒸餾水至 1000ml 配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4℃保存。 1.2.4 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸餾水至 100 ml 高溫滅菌后，室溫保存。 1.2.5 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后-20℃保存。制作蛋白標準曲線時，用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存。 1.2.6 還原型5 X SDS上樣緩沖液 0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g 溴酚藍 0.025 甘油 2.5ml 混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。 1.2.7 電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次。 （電泳液可以回收重復利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鮮的電泳緩沖液） 1.2.8 轉移緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影響轉移效率）。 （先用蒸餾水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后補足液體。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比較困難） 1.2.9 10X麗春紅染液 麗春紅S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水楊酸 30g 蒸餾水至 100ml 使用時將其稀釋10倍。 1.2.10 TBS緩沖液 1 mol/L Tris•HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸餾水至 1000ml （可以配制成10×TBS緩沖液進行保存，稀釋10倍使用） 1.2.10 TBST緩沖液 20％Tween20 1.65ml TBS 700ml 混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。 1.2.11 封閉液 (最好現(xiàn)配現(xiàn)用) 脫脂奶粉（國產(chǎn)，光明牌） 5g TBST 100ml 1.2.12 洗脫抗體緩沖液（可用可不用） 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇) 700 μl（通風廚里加） SDS 2g 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8） 12.5ml 超純水至 100ml 配制時，在通風廚內進行。4℃保存�？芍貜褪褂�1次。 1.2.18 40%聚丙烯酰胺的濃縮膠和分離膠配制 組 分 10％分離膠（兩塊膠，10ml） 4％濃縮膠（兩塊膠，5ml） 超純水 4.85ml 3.16ml 40％Acr/Bic（37.5:1） 2.5ml 0.5ml 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml － 0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） － 1.26ml 10％ SDS 100 μl 50 μl 10% AP 50 μl 25μl TEMED 5 μl 5 μl *加TEMED后，立即混勻即可灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據(jù)實驗當時的溫度適當調整） 組 分 15％分離膠（兩塊膠，10ml） 7.8％濃縮膠（兩塊膠，5ml） 超純水 2.34 ml 2.065 ml 40％ Acr/Bic（37.5:1） 3.75 ml 0.975 ml 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 3.75 ml － 0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） － 1.875 ml 10％ SDS 100 μl 50 μl 10% AP 50 μl 25μl TEMED 10μl 5 μl 1.2.19 30%聚丙烯酰胺的濃縮膠和分離膠配制 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 *丙烯酰胺濃度（%） 線性分離范圍（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 *雙丙烯酰胺～丙烯酰胺摩爾比為 1：29。 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液 溶液成分 總體積 5ml 總體積 10ml 總體積 15ml 總體積 20ml 總體積 25ml 總體積 30ml 6% 水 2.6ml 5.3ml 7.9ml 10.6ml 13.2ml 15.9ml 30%丙烯酰胺 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 4μl 8μl 12μl 16μl 20μl 24μl 8% 水 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml 30%丙烯酰胺 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 3μl 6μl 9μl 12μl 15μl 18μl 10% 水 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml 30%丙烯酰胺 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl 12% 水 1.6ml 3.3ml 4.9ml 6.6ml 8.2ml 9.9ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 4.0ml 6.0ml 8.0ml 10.0ml 12.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl 15% 水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml 30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl 配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5% 濃縮膠溶液 溶液成分 總體積 3ml 總體積 4ml 總體積 5ml 總體積 6ml 總體積 8ml 水 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml 30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml 1M Tris(pH 6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml 10% SDS 30μl 40μl 50μl 60μl 80μl 10%過硫酸胺 30μl 40μl 50μl 60μl 80μl TEMED 3μl 4μl 5μl 6μl 8μl |
9樓2011-05-22 11:07:16
xuguanghai
木蟲 (職業(yè)作家)
- BioEPI: 3
- 應助: 17 (小學生)
- 金幣: 2841.2
- 散金: 2764
- 紅花: 16
- 沙發(fā): 42
- 帖子: 3072
- 在線: 296.7小時
- 蟲號: 449061
- 注冊: 2007-11-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 有機合成
【答案】應助回帖
★
qiang7(金幣+1): 濃縮膠都濃縮了近1h了 還有沒有什么關鍵因素��？ 2011-05-18 11:11:22
adslye(金幣+1): 鼓勵交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:13
qiang7(金幣+1): 濃縮膠都濃縮了近1h了 還有沒有什么關鍵因素��？ 2011-05-18 11:11:22
adslye(金幣+1): 鼓勵交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:13
|
會不會是分離膠中的聚丙酰胺沒有聚合，蛋白沒有孔徑進入分離膠，一般30分鐘左右分離膠都能聚合，TEMED的量不能太多，只是起加速聚合作用，多的話會使膠變硬，變脆，膠容易裂開，蛋白肯定就跑不進孔徑里了。覺得可能還是膠那里出了問題。 http://www.app17.com/dating/d805.html |
3樓2011-05-18 10:47:56
【答案】應助回帖
★
qiang7(金幣+2): 您說的這些都注意到了 2011-05-22 10:47:35
adslye(金幣+1): 鼓勵交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:43
qiang7(金幣+2): 您說的這些都注意到了 2011-05-22 10:47:35
adslye(金幣+1): 鼓勵交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:43
| 這個問題我也遇到過，后來解決了。首先分離膠水封或者異丙醇封得時候不能干，也就是說分離膠和濃縮膠之間的界面不能干，這兩個界面很容易有空隙，進入空氣一般就會漏孔。再有就是梳子是不是太緊？梳子太緊容易造成拔梳子的時候將濃縮膠帶起來，和分離膠分離了有空隙。再有就是玻板是不是新的？新的上面有一層油，要洗干凈，否則，膠和板之間容易不緊，造成漏膠。我認為試劑應該沒有太大問題，如果是一直使用的試劑。檢查一下細節(jié)問題吧。 |
7樓2011-05-21 23:23:13
8樓2011-05-21 23:26:52
qiang7
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1476.2
- 散金: 16
- 紅花: 1
- 帖子: 275
- 在線: 51.9小時
- 蟲號: 868711
- 注冊: 2009-10-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學
2樓2011-05-18 10:34:23
qiang7
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1476.2
- 散金: 16
- 紅花: 1
- 帖子: 275
- 在線: 51.9小時
- 蟲號: 868711
- 注冊: 2009-10-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學
4樓2011-05-18 11:04:13
qiang7
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1476.2
- 散金: 16
- 紅花: 1
- 帖子: 275
- 在線: 51.9小時
- 蟲號: 868711
- 注冊: 2009-10-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學
5樓2011-05-21 10:21:56
dengxuepeng
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 892.3
- 散金: 143
- 紅花: 7
- 帖子: 199
- 在線: 206.2小時
- 蟲號: 1057483
- 注冊: 2010-07-14
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術藥物
6樓2011-05-21 16:46:55
10樓2011-05-22 13:02:35
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 qiang7 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿蘇州大學材料求調劑，總分315（英一） +3 | sbdksD 2026-03-19 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 294求調劑材料與化工專碩 +14 | 陌の森林 2026-03-18 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 梁成偉老師課題組歡迎你的加入 +9 | 一鴨鴨喲 2026-03-14 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 化學求調劑 +3 | 臨澤境llllll 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿 西北大學 ，070300化學學碩，總分287，雙非一本，求調劑。 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 346求調劑[0856] +3 | WayneLim327 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 354求調劑 +4 | Tyoumou 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 311求調劑 +6 | 26研0 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 299求調劑 +5 | △小透明* 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 268求調劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 308求調劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 東南大學364求調劑 +5 | JasonYuiui 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 機械專碩325，尋找調劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請]
今年的國基金是打分制嗎？
 50+3
|
zhanghaozhu 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856求調劑 +3 | 劉夢微 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 070305求調劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 中科大材料專碩319求調劑 +3 | 孟鑫材料 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 297求調劑 +4 | 學海漂泊 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調劑 +7 | 7712b 2026-03-13 | 7/350 |
|