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shenxing325銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助，Western-Blot轉(zhuǎn)膜不成功
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各位蟲(chóng)友，做了兩次Western-Blot轉(zhuǎn)膜都不成功，想各位幫我指點(diǎn)一下可能的原因，這些是我做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候的條件細(xì)節(jié)： 目的蛋白大小100kD左右，用的是濕轉(zhuǎn)法，電轉(zhuǎn)緩沖液（5×）的配方是： Glycine 15.1g Tris 72g SDS 5g 定容至一升，使用前取200mL，再加700mL水和100mL甲醇，4度備用 濾紙（3mm濾紙用兩邊各用兩層）比膜和膠大比較多，之前看過(guò)一些人說(shuō)濾紙要比膜小，但是好像大多數(shù)人都說(shuō)對(duì)于濕轉(zhuǎn)來(lái)說(shuō)沒(méi)有關(guān)系。 膜用的是0.45um的PVDF膜，這個(gè)有人說(shuō)要用0.22um的，是這樣嗎？ 電轉(zhuǎn)于4度冰柜中進(jìn)行，80V電壓，時(shí)間2h，用立春紅染色，但是什么都沒(méi)有，我沒(méi)有用預(yù)染Marker。 看大多數(shù)人都說(shuō)濕轉(zhuǎn)是非常容易成功的，我的實(shí)驗(yàn)操作哪里有問(wèn)題嗎？請(qǐng)指教，謝謝！ |
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qiyaocheng
木蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)交流！ 2012-01-15 16:07:54
amisking: 金幣+10, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-10-17 20:45:31
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有些經(jīng)驗(yàn)性的東西看看對(duì)你能否有用處 1. SDS-PAGE，首先看你的電泳有沒(méi)有跑好，將兩塊膠同樣上樣電泳，最好是在一個(gè)電泳槽里面電泳。伯樂(lè)的mini槽蠻好的，又快功能又多，我們一直用。一塊用于考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊用于轉(zhuǎn)膜，切記。一定要能在你的對(duì)照膠上找到你的蛋白質(zhì)。 2. 切膠做三明治。PVDF膜在純甲醇中活化30s（用鑷子按到甲醇里），取出放入轉(zhuǎn)移緩存液中備用。切膠盡量大小合適一點(diǎn)，別拿整塊膠上去搞，膜與膠大小一致，濾紙小一點(diǎn)即可，千萬(wàn)不能大了，大了絕對(duì)是會(huì)短路的（因?yàn)槟闶且阉鼔壕o的，濕濾紙接觸后電阻小，直接繞過(guò)膠了）。整個(gè)切膠過(guò)程要濕潤(rùn)，切好了膠立即放入轉(zhuǎn)移緩存液中，所有過(guò)程戴手套進(jìn)行，鑷子夾取時(shí)不能夾到中間。 三明治順序：負(fù)極－濾紙（2－3層）－膠－PVDF膜－濾紙－正極，每一層都要趕走氣泡，氣泡很容易發(fā)現(xiàn)，用玻璃棒搟，一定不要用槍頭戳（很容易戳壞濾紙，尤其是膠） 夾緊過(guò)程要果斷迅速，不然會(huì)錯(cuò)位。 3. 轉(zhuǎn)膜。首先，轉(zhuǎn)膜緩沖液要充足，配方要準(zhǔn)確，其中涉及到SDS和甲醇的比例，這兩者是消長(zhǎng)關(guān)系。一般認(rèn)為，如果是小分子量的蛋白比如十幾KD，甲醇比例要高（我加了30%的甲醇就徹底沒(méi)有加SDS），大分子量的則SDS要高，甲醇要低（這是某公司技術(shù)總監(jiān)說(shuō)的經(jīng)驗(yàn)）。 其次，是轉(zhuǎn)膜的緩沖液要冷，大家都知道要預(yù)冷，可是整個(gè)過(guò)程產(chǎn)熱很嚴(yán)重的，條件差一點(diǎn)的也要放4度冰箱，一般用“冰水浴”（冰水浴傳熱效果好），伯樂(lè)的mini槽都配有冰盒，建議拆掉一包生物冰袋，把膠狀物倒到冰盒里面凍成冰，尤其要注意不能倒太多，容易把冰盒撐變形，最多70%即可（一般冰塊很容易就化光了，生物冰袋持久一些）。 最后，轉(zhuǎn)膜條件。一定要找到最佳的轉(zhuǎn)膜條件，這個(gè)能借鑒的很多，根據(jù)實(shí)際情況自己摸索一下，電壓和時(shí)間，注意要轉(zhuǎn)完全啊，最好是能帶著預(yù)染Marker一起，這就方便多了。有個(gè)流程上說(shuō)小于120KD的蛋白250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours，參考一下。 4. 清洗平衡，將PVDF膜放入1X TBST中浸泡5分鐘。搖床搖動(dòng)。這一步很重要，從含有甲醇的有機(jī)相中轉(zhuǎn)入水相中的過(guò)渡。 5. 封閉，將膜面（載有蛋白的一面）朝上，放入封閉液中，4度過(guò)夜封閉。 至此，前半段基本完成，這時(shí)就已經(jīng)很晚了，兄弟，可以回去睡覺(jué)了 |
10樓2012-01-15 13:33:12
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22樓2014-06-27 23:08:58
西瓜
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2樓2012-01-12 21:14:25
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4樓2012-01-13 07:25:42
dnaxxx
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