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shenxing325銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助，Western-Blot轉(zhuǎn)膜不成功
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各位蟲友，做了兩次Western-Blot轉(zhuǎn)膜都不成功，想各位幫我指點一下可能的原因，這些是我做實驗的時候的條件細節(jié)： 目的蛋白大小100kD左右，用的是濕轉(zhuǎn)法，電轉(zhuǎn)緩沖液（5×）的配方是： Glycine 15.1g Tris 72g SDS 5g 定容至一升，使用前取200mL，再加700mL水和100mL甲醇，4度備用 濾紙（3mm濾紙用兩邊各用兩層）比膜和膠大比較多，之前看過一些人說濾紙要比膜小，但是好像大多數(shù)人都說對于濕轉(zhuǎn)來說沒有關(guān)系。 膜用的是0.45um的PVDF膜，這個有人說要用0.22um的，是這樣嗎？ 電轉(zhuǎn)于4度冰柜中進行，80V電壓，時間2h，用立春紅染色，但是什么都沒有，我沒有用預染Marker。 看大多數(shù)人都說濕轉(zhuǎn)是非常容易成功的，我的實驗操作哪里有問題嗎？請指教，謝謝！ |
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qiyaocheng
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【答案】應助回帖
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wanhscn(金幣+2): 鼓勵交流！ 2012-01-15 16:07:54
amisking: 金幣+10, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2012-10-17 20:45:31
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有些經(jīng)驗性的東西看看對你能否有用處 1. SDS-PAGE，首先看你的電泳有沒有跑好，將兩塊膠同樣上樣電泳，最好是在一個電泳槽里面電泳。伯樂的mini槽蠻好的，又快功能又多，我們一直用。一塊用于考馬斯亮藍染色，另一塊用于轉(zhuǎn)膜，切記。一定要能在你的對照膠上找到你的蛋白質(zhì)。 2. 切膠做三明治。PVDF膜在純甲醇中活化30s（用鑷子按到甲醇里），取出放入轉(zhuǎn)移緩存液中備用。切膠盡量大小合適一點，別拿整塊膠上去搞，膜與膠大小一致，濾紙小一點即可，千萬不能大了，大了絕對是會短路的（因為你是要把它壓緊的，濕濾紙接觸后電阻小，直接繞過膠了）。整個切膠過程要濕潤，切好了膠立即放入轉(zhuǎn)移緩存液中，所有過程戴手套進行，鑷子夾取時不能夾到中間。 三明治順序：負極－濾紙（2－3層）－膠－PVDF膜－濾紙－正極，每一層都要趕走氣泡，氣泡很容易發(fā)現(xiàn)，用玻璃棒搟，一定不要用槍頭戳（很容易戳壞濾紙，尤其是膠） 夾緊過程要果斷迅速，不然會錯位。 3. 轉(zhuǎn)膜。首先，轉(zhuǎn)膜緩沖液要充足，配方要準確，其中涉及到SDS和甲醇的比例，這兩者是消長關(guān)系。一般認為，如果是小分子量的蛋白比如十幾KD，甲醇比例要高（我加了30%的甲醇就徹底沒有加SDS），大分子量的則SDS要高，甲醇要低（這是某公司技術(shù)總監(jiān)說的經(jīng)驗）。 其次，是轉(zhuǎn)膜的緩沖液要冷，大家都知道要預冷，可是整個過程產(chǎn)熱很嚴重的，條件差一點的也要放4度冰箱，一般用“冰水浴”（冰水浴傳熱效果好），伯樂的mini槽都配有冰盒，建議拆掉一包生物冰袋，把膠狀物倒到冰盒里面凍成冰，尤其要注意不能倒太多，容易把冰盒撐變形，最多70%即可（一般冰塊很容易就化光了，生物冰袋持久一些）。 最后，轉(zhuǎn)膜條件。一定要找到最佳的轉(zhuǎn)膜條件，這個能借鑒的很多，根據(jù)實際情況自己摸索一下，電壓和時間，注意要轉(zhuǎn)完全啊，最好是能帶著預染Marker一起，這就方便多了。有個流程上說小于120KD的蛋白250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours，參考一下。 4. 清洗平衡，將PVDF膜放入1X TBST中浸泡5分鐘。搖床搖動。這一步很重要，從含有甲醇的有機相中轉(zhuǎn)入水相中的過渡。 5. 封閉，將膜面（載有蛋白的一面）朝上，放入封閉液中，4度過夜封閉。 至此，前半段基本完成，這時就已經(jīng)很晚了，兄弟，可以回去睡覺了 |
10樓2012-01-15 13:33:12
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22樓2014-06-27 23:08:58
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