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[交流]
Western Blot 磷酸化蛋白測定問題 已有8人參與
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WB菜鳥最近做ERK蛋白表達 用的碧云天的Western及IP細胞裂解液（說明說適用于磷酸化蛋白的Western檢測） 伯樂半干轉膜 恒壓20V，25min 5%脫脂奶室溫搖床封閉1h 一抗室溫搖床1h，4度過夜 HRP標記的二抗室溫搖床孵育1小時 TMB顯色 結果：ERK蛋白表達有條帶 p-ERK在NC膜上只有預染Marker沒有任何條帶或是背景 請教WB達人為什么p-ERK會是這樣的情況，還有這個問題要怎么解決？ 各位大俠賜教呀�。�！ [ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 22:05 ] |
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一、Western Blot實驗條帶沒出現的原因分析及解決辦法 ： 原因分析 解決辦法 1.一抗和二抗失效 1. 更換抗體；選擇現用現配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更換為同種同屬的同亞型的抗體底物 3.發(fā)光液失效 3. 更換新的發(fā)光液 4.抗體染色不充分 4. 增加抗體濃度；延長孵育時間 5.被測樣品中不含有目的蛋白質或者目的 蛋白質含量太低 5. 設置陽性對照。確定標本中是否含有目的蛋白質； 增加樣品 的上樣量。 6. 溶液中有辣根過氧化物酶的抑制劑 6.用透析和超濾除去所用溶液中如疊氮化鈉之類的抑制劑 7.抗體活力降低 7.在抗體活力保存時間內使用抗體；工作液現用現配 二、一抗與二抗的專一性識別檢測，就是蛋白質-蛋白質相互作用檢測，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量轉移、分子篩層析等。 |
7樓2014-07-12 00:47:02
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