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geek23木蟲 (小有名氣)
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[求助]
WB檢測(cè)磷酸化蛋白
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| 各位大俠,有用過CST的磷酸化抗體檢測(cè)磷酸化蛋白的嗎?請(qǐng)問在整個(gè)提蛋白以及WB過程中有什么注意事項(xiàng)?小女最近做了幾個(gè)抗體都沒有條帶.急~~~ |
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geek23
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【答案】應(yīng)助回帖
silicare(金幣+5, BioEPI+1): 謝謝參與 2012-02-20 12:45:53
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1關(guān)于細(xì)胞裂解:我們一般先收集細(xì)胞再加入裂解液,裂解液的體積根據(jù)細(xì)胞的多少而定,不要太多,一般我們10厘米的盤子80%的細(xì)胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分鐘,每隔兩分鐘vortex一下(15s).然后13000rpm 離心30分鐘,取上清. 2關(guān)于上樣量:這個(gè)根據(jù)你要檢測(cè)的蛋白在你細(xì)胞中的表達(dá)情況,一般表達(dá)量高達(dá)的,如PARP, SURVIVIN之類的我們就加40-50微克,而表達(dá)量低的我們也曾經(jīng)加到100微克以上,當(dāng)然了這個(gè)要求你的蛋白濃度相對(duì)較高,否則上樣就是個(gè)問題.所以對(duì)于第一次做的蛋白,建議你先查文獻(xiàn),看看別人文獻(xiàn)里報(bào)道該蛋白在特定細(xì)胞中的表達(dá)情況,再?zèng)Q定上樣量. 3關(guān)于轉(zhuǎn)膜:我們一般是恒壓,100v轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí),100kd以上的就是一個(gè)半小時(shí).注意電流不能太大,轉(zhuǎn)膜槽里加轉(zhuǎn)子,防止局部溫度過高,必要時(shí)加冰壺,冰浴轉(zhuǎn)膜. 4β-actin不好看的問題:這個(gè)和你的上樣量還有上樣體積有很大關(guān)系,如果體積過大的話,β-actin跑成一條線的問題很常見,我們經(jīng)常遇到,個(gè)人覺得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵 個(gè)人意見哈~ |
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zplipeng24樓2011-12-14 13:22:55
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【答案】應(yīng)助回帖
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adslye(金幣+1): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-08-15 17:49:33
geek23(金幣+5): 請(qǐng)問樓上.我主要是做藥物處理后一些蛋白的表達(dá),我一般是加藥后48H提蛋白.你的意思是說縮短時(shí)間間隔嗎?謝謝你的回答. 2011-08-16 16:49:42
adslye(金幣+1): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-08-15 17:49:33
geek23(金幣+5): 請(qǐng)問樓上.我主要是做藥物處理后一些蛋白的表達(dá),我一般是加藥后48H提蛋白.你的意思是說縮短時(shí)間間隔嗎?謝謝你的回答. 2011-08-16 16:49:42
| CST的抗體應(yīng)該不錯(cuò)，但不知你的是單克隆還是多克隆，沒有條帶，是不是磷酸化沒有形成。磷酸化有時(shí)形成的時(shí)間比較短，做實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格對(duì)待。 |
3樓2011-08-15 16:48:37
geek23
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adslye(金幣+3): 認(rèn)真的回復(fù)，感謝您~祝順利！ 2011-08-17 10:31:21
adslye(金幣+3): 認(rèn)真的回復(fù)，感謝您~祝順利！ 2011-08-17 10:31:21
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1、看文獻(xiàn)，看看攻略，到底你這個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下什么時(shí)間，多大濃度才有最好的磷酸化。 2、可以自己摸，不同時(shí)間如6h、18h、36h、54h。四個(gè)條件分別做，找出兩個(gè)時(shí)間段較好結(jié)果，然后取中間時(shí)間再試驗(yàn)。 3、最后能找個(gè)已經(jīng)報(bào)道過的成熟的刺激條件，無論是什么藥的。（陽(yáng)性對(duì)照），提出蛋白看有沒有磷酸化形成。排除是你wb的實(shí)驗(yàn)問題。要是wb沒問題那就肯定是沒形成磷酸化。 4、實(shí)驗(yàn)就是這樣自己一點(diǎn)一點(diǎn)摸。 |
6樓2011-08-16 18:37:57
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7樓2011-08-16 20:10:24
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