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geek23木蟲 (小有名氣)
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WB檢測磷酸化蛋白
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| 各位大俠,有用過CST的磷酸化抗體檢測磷酸化蛋白的嗎?請問在整個提蛋白以及WB過程中有什么注意事項?小女最近做了幾個抗體都沒有條帶.急~~~ |
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【答案】應(yīng)助回帖
silicare(金幣+5, BioEPI+1): 謝謝參與 2012-02-20 12:45:53
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1關(guān)于細胞裂解:我們一般先收集細胞再加入裂解液,裂解液的體積根據(jù)細胞的多少而定,不要太多,一般我們10厘米的盤子80%的細胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分鐘,每隔兩分鐘vortex一下(15s).然后13000rpm 離心30分鐘,取上清. 2關(guān)于上樣量:這個根據(jù)你要檢測的蛋白在你細胞中的表達情況,一般表達量高達的,如PARP, SURVIVIN之類的我們就加40-50微克,而表達量低的我們也曾經(jīng)加到100微克以上,當(dāng)然了這個要求你的蛋白濃度相對較高,否則上樣就是個問題.所以對于第一次做的蛋白,建議你先查文獻,看看別人文獻里報道該蛋白在特定細胞中的表達情況,再決定上樣量. 3關(guān)于轉(zhuǎn)膜:我們一般是恒壓,100v轉(zhuǎn)一個小時,100kd以上的就是一個半小時.注意電流不能太大,轉(zhuǎn)膜槽里加轉(zhuǎn)子,防止局部溫度過高,必要時加冰壺,冰浴轉(zhuǎn)膜. 4β-actin不好看的問題:這個和你的上樣量還有上樣體積有很大關(guān)系,如果體積過大的話,β-actin跑成一條線的問題很常見,我們經(jīng)常遇到,個人覺得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵 個人意見哈~ |
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zplipeng24樓2011-12-14 13:22:55
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