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qiang7金蟲 (小有名氣)
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[求助]
Western Blot電泳蛋白質(zhì)外漏問題求助
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求助各位高手指點(diǎn)，本人最近蛋白電泳過程中經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白樣品剛跑離樣品孔還沒進(jìn)入分離膠的時(shí)候，樣品就漏下來了！如下圖所示。在我想的問題都找遍了，比如濃縮膠濃縮時(shí)間，玻璃板清洗問題及玻璃板都換新的了，還有試劑都換了一套，還是漏 真不知道還有什么致命因素沒有找到，請(qǐng)各位大俠指點(diǎn)！小弟將不勝感激！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白電泳 漏樣 |
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【答案】應(yīng)助回帖
qiang7(金幣+5): 謝謝您的熱心，我再細(xì)細(xì)的查找一遍 2011-05-22 15:19:27
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35
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肯定是你液體配制中的問題，這是我的配方，可以參考一下。 1. 試劑配制 1.1母液 1.1.1 1.0mol/L Tris•HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸餾水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl 7.4 約17ml 7.5 約16m 7.6 約15ml 8.0 約10ml 1.1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 異丙醇 100ml 溶解后，分裝于1.5ml離心管中，-20℃保存。 1.1.3 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸餾水至 500ml 溶解后，高壓滅菌，室溫保存。 1.1.4 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO •12H2O（MW 358.14） 71.6g 蒸餾水至 1000ml 溶解后，高壓滅菌，室溫保存。 1.1.5 10％SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml 50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 1.1.6 10％過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g 超純水 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存時(shí)間為1周。 （可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中，一次性多裝幾管，使用時(shí)加入超純水即可） 1.1.7 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超純水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。 1.1.8 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超純水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。 1.1.9 40％Acr/Bic（37.5:1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g 甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g 超純水至 100ml 溶解后4℃保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。 1.1.10 30％Acr/Bic（29:1） 丙稀酰胺（Acr） 29g 甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g 超純水至 100ml 溶解后4℃保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。 1.1.11 20％Tween20 Tween20 20ml 蒸餾水至 100ml 混勻后4℃保存。 1.2 使用液配制 1.2.1 單去污劑裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris•HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml 蒸餾水至 50ml 混勻后4℃保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 一般實(shí)際用的比較多的其實(shí)是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方： 50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS。 裂解得到的蛋白樣品，由于含有較高的蛋白去垢劑干擾，不能用Brandford法測(cè)定蛋白濃度,要用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。 RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度大致可以分為強(qiáng)、中、弱三類。對(duì)于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)。如果發(fā)現(xiàn)IP的時(shí)候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強(qiáng)度過強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 對(duì)于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或SDS裂解液。 1.2.2 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO4 81ml NaCl 17g 蒸餾水至 2000ml 1.2.3 G250考馬斯亮藍(lán)溶液（蛋白定量專用） 考馬斯亮藍(lán)G250 100mg 95％乙醇 50ml 磷酸 100ml 蒸餾水至 1000ml 配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4℃保存。 1.2.4 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸餾水至 100 ml 高溫滅菌后，室溫保存。 1.2.5 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后-20℃保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0.15 mol/L NaCl進(jìn)行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存。 1.2.6 還原型5 X SDS上樣緩沖液 0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g 溴酚藍(lán) 0.025 甘油 2.5ml 混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。 1.2.7 電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次。 （電泳液可以回收重復(fù)利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鮮的電泳緩沖液） 1.2.8 轉(zhuǎn)移緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影響轉(zhuǎn)移效率）。 （先用蒸餾水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后補(bǔ)足液體。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比較困難） 1.2.9 10X麗春紅染液 麗春紅S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水楊酸 30g 蒸餾水至 100ml 使用時(shí)將其稀釋10倍。 1.2.10 TBS緩沖液 1 mol/L Tris•HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸餾水至 1000ml （可以配制成10×TBS緩沖液進(jìn)行保存，稀釋10倍使用） 1.2.10 TBST緩沖液 20％Tween20 1.65ml TBS 700ml 混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。 1.2.11 封閉液 (最好現(xiàn)配現(xiàn)用) 脫脂奶粉（國產(chǎn)，光明牌） 5g TBST 100ml 1.2.12 洗脫抗體緩沖液（可用可不用） 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇) 700 μl（通風(fēng)廚里加） SDS 2g 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8） 12.5ml 超純水至 100ml 配制時(shí)，在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。4℃保存�？芍貜�(fù)使用1次。 1.2.18 40%聚丙烯酰胺的濃縮膠和分離膠配制 組 分 10％分離膠（兩塊膠，10ml） 4％濃縮膠（兩塊膠，5ml） 超純水 4.85ml 3.16ml 40％Acr/Bic（37.5:1） 2.5ml 0.5ml 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml － 0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） － 1.26ml 10％ SDS 100 μl 50 μl 10% AP 50 μl 25μl TEMED 5 μl 5 μl *加TEMED后，立即混勻即可灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據(jù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)時(shí)的溫度適當(dāng)調(diào)整） 組 分 15％分離膠（兩塊膠，10ml） 7.8％濃縮膠（兩塊膠，5ml） 超純水 2.34 ml 2.065 ml 40％ Acr/Bic（37.5:1） 3.75 ml 0.975 ml 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 3.75 ml － 0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） － 1.875 ml 10％ SDS 100 μl 50 μl 10% AP 50 μl 25μl TEMED 10μl 5 μl 1.2.19 30%聚丙烯酰胺的濃縮膠和分離膠配制 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 *丙烯酰胺濃度（%） 線性分離范圍（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 *雙丙烯酰胺～丙烯酰胺摩爾比為 1：29。 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液 溶液成分 總體積 5ml 總體積 10ml 總體積 15ml 總體積 20ml 總體積 25ml 總體積 30ml 6% 水 2.6ml 5.3ml 7.9ml 10.6ml 13.2ml 15.9ml 30%丙烯酰胺 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 4μl 8μl 12μl 16μl 20μl 24μl 8% 水 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml 30%丙烯酰胺 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 3μl 6μl 9μl 12μl 15μl 18μl 10% 水 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml 30%丙烯酰胺 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl 12% 水 1.6ml 3.3ml 4.9ml 6.6ml 8.2ml 9.9ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 4.0ml 6.0ml 8.0ml 10.0ml 12.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl 15% 水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml 30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl 10%過硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl 配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5% 濃縮膠溶液 溶液成分 總體積 3ml 總體積 4ml 總體積 5ml 總體積 6ml 總體積 8ml 水 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml 30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml 1M Tris(pH 6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml 10% SDS 30μl 40μl 50μl 60μl 80μl 10%過硫酸胺 30μl 40μl 50μl 60μl 80μl TEMED 3μl 4μl 5μl 6μl 8μl |
9樓2011-05-22 11:07:16
xuguanghai
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【答案】應(yīng)助回帖
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qiang7(金幣+1): 濃縮膠都濃縮了近1h了 還有沒有什么關(guān)鍵因素啊？ 2011-05-18 11:11:22
adslye(金幣+1): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:13
qiang7(金幣+1): 濃縮膠都濃縮了近1h了 還有沒有什么關(guān)鍵因素啊？ 2011-05-18 11:11:22
adslye(金幣+1): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:13
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會(huì)不會(huì)是分離膠中的聚丙酰胺沒有聚合，蛋白沒有孔徑進(jìn)入分離膠，一般30分鐘左右分離膠都能聚合，TEMED的量不能太多，只是起加速聚合作用，多的話會(huì)使膠變硬，變脆，膠容易裂開，蛋白肯定就跑不進(jìn)孔徑里了。覺得可能還是膠那里出了問題。 http://www.app17.com/dating/d805.html |
3樓2011-05-18 10:47:56
grapes
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【答案】應(yīng)助回帖
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qiang7(金幣+2): 您說的這些都注意到了 2011-05-22 10:47:35
adslye(金幣+1): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:43
qiang7(金幣+2): 您說的這些都注意到了 2011-05-22 10:47:35
adslye(金幣+1): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-09-26 09:11:43
| 這個(gè)問題我也遇到過，后來解決了。首先分離膠水封或者異丙醇封得時(shí)候不能干，也就是說分離膠和濃縮膠之間的界面不能干，這兩個(gè)界面很容易有空隙，進(jìn)入空氣一般就會(huì)漏孔。再有就是梳子是不是太緊？梳子太緊容易造成拔梳子的時(shí)候?qū)饪s膠帶起來，和分離膠分離了有空隙。再有就是玻板是不是新的？新的上面有一層油，要洗干凈，否則，膠和板之間容易不緊，造成漏膠。我認(rèn)為試劑應(yīng)該沒有太大問題，如果是一直使用的試劑。檢查一下細(xì)節(jié)問題吧。 |
7樓2011-05-21 23:23:13
grapes
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4樓2011-05-18 11:04:13
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10樓2011-05-22 13:02:35
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[考研] 0856調(diào)劑，是學(xué)校就去 +8 | sllhht 2026-03-19 | 9/450 |
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[考研] 一志愿西南交通 專碩 材料355 本科雙非 求調(diào)劑 +4 | 西南交通專材355 2026-03-19 | 4/200 |
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[考研] 一志愿天津大學(xué)化學(xué)工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑 +11 | yangfz 2026-03-17 | 11/550 |
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[考研] 一志愿西安交通大學(xué)材料工程專業(yè) 282分求調(diào)劑 +5 | 楓橋ZL 2026-03-18 | 7/350 |
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[考研] 化學(xué)求調(diào)劑 +3 | 臨澤境llllll 2026-03-17 | 4/200 |
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[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +5 | pupcoco 2026-03-17 | 8/400 |
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[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 3/150 |
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[考研] 346求調(diào)劑[0856] +3 | WayneLim327 2026-03-16 | 6/300 |
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[考研] 311求調(diào)劑 +4 | 冬十三 2026-03-18 | 4/200 |
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[考研] 295求調(diào)劑 +3 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 5/250 |
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[考研] 085601專碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限 +5 | share_joy 2026-03-16 | 5/250 |
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[考研] 收復(fù)試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
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[考研]
 0854，計(jì)算機(jī)類招收調(diào)劑
+3
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胡辣湯放糖 2026-03-15 | 6/300 |
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[考研] 326求調(diào)劑 +5 | 上岸的小葡 2026-03-15 | 6/300 |
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[考研]
11408 一志愿西電，277分求調(diào)劑
+3
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zhouzhen654 2026-03-16 | 3/150 |
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[基金申請(qǐng)]
今年的國基金是打分制嗎？
 50+3
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zhanghaozhu 2026-03-14 | 3/150 |
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[考研] 304求調(diào)劑 +4 | ahbd 2026-03-14 | 4/200 |
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[考研] 一志愿211 0703方向310分求調(diào)劑 +3 | 努力奮斗112 2026-03-15 | 3/150 |
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[考研] 297一志愿上交085600求調(diào)劑 +5 | 指尖八千里 2026-03-14 | 5/250 |
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[考研] 一志愿哈工大材料324分求調(diào)劑 +5 | 閆旭東 2026-03-14 | 5/250 |
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