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Fire0304銀蟲 (小有名氣)
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western blot 求助，請高手指點一下
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初次做western blot，蛋白分子量是57kD， 第一次試驗：濃縮膠4% 80V，分離膠10%，100V， PVDF膜轉(zhuǎn)膜300mA 60min，麗春紅染色無條帶，封閉2h，一抗1:300，內(nèi)參抗體1:500,4°C過夜，二抗1:2000,室溫1h 結(jié)果：目的蛋白6條帶均出現(xiàn)，但不清晰，內(nèi)參條帶未見，多次壓片結(jié)果同上。 第二次試驗：濃縮膠4%，40V，分離膠10%，85V，PVDF膜轉(zhuǎn)膜250mA 80min，用上次及新配的一抗、內(nèi)參抗體、二抗，余條件不變。 結(jié)果：目的蛋白條帶均未見。內(nèi)參條帶出現(xiàn)，但不清晰。多次壓片結(jié)果同上。用考馬斯亮藍染膠未見蛋白條帶。 第三次實驗：濃縮膠4%，30V，分離膠10%，60V，其余均與第二次實驗條件相同，結(jié)果什么都沒有看到，過后考馬斯亮藍染膠、染膜均可見清晰蛋白條帶，但條帶聚集較緊湊。 分析：第一次實驗有結(jié)果，但內(nèi)參未見，第二次實驗無結(jié)果，但可見內(nèi)參一，用的是新舊一抗，內(nèi)參抗體及二抗，第三次實驗無結(jié)果，抗體同前，考慮一抗出現(xiàn)問題。 考馬斯亮藍染膠、染膜均可見清晰蛋白條帶，但條帶聚集較緊湊，考慮膠濃度過大。 請各位高手指點一下，讓小弟可順利完成實驗。。。。謝謝 |
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2樓2011-08-13 00:38:43
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+4, MolEPI+1): Good 2011-08-14 09:09:32
Fire0304(金幣+5): 有幫助，實驗后來算是成功了 2011-11-09 00:01:48
西瓜(金幣+4, MolEPI+1): Good 2011-08-14 09:09:32
Fire0304(金幣+5): 有幫助，實驗后來算是成功了 2011-11-09 00:01:48
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前后幾次試驗的page膠配制情況是否穩(wěn)定？為何要不停的降低電壓？ 麗春紅有時候不夠敏感，染不出來的時候也不能確定就一定沒轉(zhuǎn)到膜上 麗春紅能染上肯定是電泳和轉(zhuǎn)膜都很不錯了。 像你這種情況其實可以分別做2塊膠，轉(zhuǎn)2塊膜，分別用第一次和第二次轉(zhuǎn)膜的條件來做目的片段和內(nèi)參。 |
6樓2011-08-13 22:09:51
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7樓2011-08-15 19:49:20
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8樓2011-08-15 19:54:41
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9樓2011-08-15 20:01:08
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