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[交流]
【求助/交流】請教Western blot出現(xiàn)非特異性條帶的怎么解決
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| 大家好，我的蛋白是30KD，我做Western blot封閉用的是30%的BSA，時間是4度過夜，我用的一抗是兔抗組氨酸標(biāo)簽抗體，37度孵育2h，二抗是羊抗兔的37度孵育2h，但是結(jié)果總出現(xiàn)非特異性條帶，請高手幫幫忙！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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ben1147
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WB出現(xiàn)非特異性條帶的原因與解決方法： 1.抗體濃度過高；降低一抗、二抗的濃度。 2.一抗的特異性不足；使用單克隆抗體。 3.二抗的非特異性結(jié)合，不加一抗，其他操作不變，即可檢測出二抗的非特異性的條帶是否來自二抗的非特異性結(jié)合；此時需要重新選擇二抗。 4.樣品蛋白質(zhì)上樣量過大；降低上樣量。 5.樣品蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，降解產(chǎn)物成為了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是單克隆抗體時更為明顯；避免對樣品蛋白質(zhì)反復(fù)凍融，食用新鮮的蛋白質(zhì)樣品，可以使用蛋白酶的廣譜抑制劑（已經(jīng)有商用產(chǎn)品），必要的話使用分子篩層析或HPLC純化蛋白質(zhì)樣品后再上樣（HPLC不能用于蛋白質(zhì)制備，不過用做WB的量還是能夠提供的）。 6.細(xì)胞傳代過多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變異。使用傳代次數(shù)少的細(xì)胞的表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行對比，并且作為分子篩層析或HPLC的純化標(biāo)準(zhǔn)。 |
9樓2014-07-12 00:23:01
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