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yesucao木蟲 (正式寫手)
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[求助]
連接后轉(zhuǎn)化子PCR出現(xiàn)非特異性的條帶
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實驗主要內(nèi)容： 1、將目的基因和已經(jīng)連有啟動子的載體連接，挑單菌落PCR驗證是否含有目的條帶 2、挑取能 P 出條帶的單菌落，搖菌，保藏，提質(zhì)粒 3、用提取的質(zhì)粒，再次PCR驗證是否含有啟動子基因 問題： PCR驗證是否含有啟動子的時候，跑膠結(jié)果顯示：除了自己的啟動子條帶，還出現(xiàn)2條非特異性的條帶，但是陽性對照只有一條，之前一直是用這個體系，出現(xiàn)這樣的問題，很怕是自己搖菌的過程中出現(xiàn)污染所致。 還請各位幫忙分析一下。 目前本人已經(jīng)在做質(zhì)粒的單雙酶切驗證，結(jié)果沒出來。 如圖 左一：陽性對照（啟動子條帶1000bp多一點） 右一：Marker（4500、3000、2000、1200、800、500、200） 其他全部是質(zhì)粒PCR（每個做了兩個平行，一共7個） |
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blackrose8089
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【答案】應助回帖
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amisking(金幣+1): 鼓勵應助 2011-08-31 20:05:45
yesucao(金幣+2): 希望奇跡能出現(xiàn) 2011-09-01 10:51:28
yesucao(金幣+3): 散幣了，酶切結(jié)果出來了，實驗失敗，繼續(xù)努力 2011-09-01 15:53:36
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yesucao(金幣+3): 散幣了，酶切結(jié)果出來了，實驗失敗，繼續(xù)努力 2011-09-01 15:53:36
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樓主的退火溫度是多少?有沒有可能是非特異性擴增，我們在以前實驗碰到這樣的情況：構(gòu)建的互補載體，要擴增的目的帶是1.3k左右，擔心擴不出來，延伸時間設成2min，結(jié)果出來了2k多的片段，但測序后發(fā)現(xiàn)連入的片段居然是正確的，但是就沒再找其他原因。 |
7樓2011-08-31 20:00:53
yesucao
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blackrose8089
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9樓2011-09-01 15:54:08
10樓2012-06-25 21:52:35
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