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Fire0304

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[求助] western blot 求助，請(qǐng)高手指點(diǎn)一下

初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
第一次試驗(yàn)：濃縮膠4% 80V，分離膠10%，100V， PVDF膜轉(zhuǎn)膜300mA 60min，麗春紅染色無(wú)條帶，封閉2h，一抗1:300，內(nèi)參抗體1:500,4°C過(guò)夜，二抗1:2000,室溫1h
結(jié)果：目的蛋白6條帶均出現(xiàn)，但不清晰，內(nèi)參條帶未見(jiàn)，多次壓片結(jié)果同上。
第二次試驗(yàn)：濃縮膠4%，40V，分離膠10%，85V，PVDF膜轉(zhuǎn)膜250mA 80min，用上次及新配的一抗、內(nèi)參抗體、二抗，余條件不變。
結(jié)果：目的蛋白條帶均未見(jiàn)。內(nèi)參條帶出現(xiàn)，但不清晰。多次壓片結(jié)果同上。用考馬斯亮藍(lán)染膠未見(jiàn)蛋白條帶。
第三次實(shí)驗(yàn)：濃縮膠4%，30V，分離膠10%，60V，其余均與第二次實(shí)驗(yàn)條件相同，結(jié)果什么都沒(méi)有看到，過(guò)后考馬斯亮藍(lán)染膠、染膜均可見(jiàn)清晰蛋白條帶，但條帶聚集較緊湊。
分析：第一次實(shí)驗(yàn)有結(jié)果，但內(nèi)參未見(jiàn)，第二次實(shí)驗(yàn)無(wú)結(jié)果，但可見(jiàn)內(nèi)參一，用的是新舊一抗，內(nèi)參抗體及二抗，第三次實(shí)驗(yàn)無(wú)結(jié)果，抗體同前，考慮一抗出現(xiàn)問(wèn)題。
考馬斯亮藍(lán)染膠、染膜均可見(jiàn)清晰蛋白條帶，但條帶聚集較緊湊，考慮膠濃度過(guò)大。
請(qǐng)各位高手指點(diǎn)一下，讓小弟可順利完成實(shí)驗(yàn)。。。。謝謝

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1樓 2011-08-12 22:06:32

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西瓜

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幫頂下！
周末人少，耐心等等吧！

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2樓2011-08-13 00:38:43

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★
西瓜(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-08-13 15:46:50

告訴我一抗抗體是哪個(gè)公司的？我的條件濃縮膠5%，40V，分離膠10%。70V。轉(zhuǎn)膜100ma。2.5小時(shí)。封閉2h。一抗37°2小時(shí)（santa抗體）。二抗37°一小時(shí)。結(jié)果相當(dāng)好。

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3樓2011-08-13 09:25:34

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【答案】應(yīng)助回帖

補(bǔ)充，1:500一抗體。二抗1；1000。（碧云天二抗）

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4樓2011-08-13 09:27:14

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【答案】應(yīng)助回帖

★
西瓜(金幣+1): 問(wèn)得好 2011-08-13 15:47:05

麗春紅染色無(wú)條帶，怎么后面還做出目的條帶了？難道用麗春紅染色的膠而不是PVDF的膜？

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人有絕交，才有至交！

5樓2011-08-13 14:26:32

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+4, MolEPI+1): Good 2011-08-14 09:09:32
Fire0304(金幣+5): 有幫助，實(shí)驗(yàn)后來(lái)算是成功了 2011-11-09 00:01:48

引用回帖:

1樓: Originally posted by Fire0304 at 2011-08-12 22:06:32:
初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
第一次試驗(yàn)：濃縮膠4% 80V，分離膠10%，100V， PVDF膜轉(zhuǎn)膜300mA 60min，麗春紅染色無(wú)條帶，封閉2h，一抗1:300，內(nèi)參抗體1:500,4°C過(guò)夜，二抗1:2000,室溫1h
結(jié) ...

前后幾次試驗(yàn)的page膠配制情況是否穩(wěn)定？為何要不停的降低電壓？
麗春紅有時(shí)候不夠敏感，染不出來(lái)的時(shí)候也不能確定就一定沒(méi)轉(zhuǎn)到膜上
麗春紅能染上肯定是電泳和轉(zhuǎn)膜都很不錯(cuò)了。
像你這種情況其實(shí)可以分別做2塊膠，轉(zhuǎn)2塊膜，分別用第一次和第二次轉(zhuǎn)膜的條件來(lái)做目的片段和內(nèi)參。

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6樓2011-08-13 22:09:51

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引用回帖:

3樓: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-08-13 09:25:34:
告訴我一抗抗體是哪個(gè)公司的？我的條件濃縮膠5%，40V，分離膠10%。70V。轉(zhuǎn)膜100ma。2.5小時(shí)。封閉2h。一抗37°2小時(shí)（santa抗體）。二抗37°一小時(shí)。結(jié)果相當(dāng)好。

我也是santa抗體，抗體放久了影響大嗎，因?yàn)槭菐熃闳ツ炅粝碌�，B-actin和二抗也是同時(shí)期的，昨天又做了一次，目的蛋白沒(méi)顯示出條帶，但B-actin較好顯示出。

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7樓2011-08-15 19:49:20

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6樓: Originally posted by w2boluo at 2011-08-13 22:09:51:
前后幾次試驗(yàn)的page膠配制情況是否穩(wěn)定？為何要不停的降低電壓？
麗春紅有時(shí)候不夠敏感，染不出來(lái)的時(shí)候也不能確定就一定沒(méi)轉(zhuǎn)到膜上
麗春紅能染上肯定是電泳和轉(zhuǎn)膜都很不錯(cuò)了。
像你這種情況其實(shí)可以分別做2塊 ...

之前配膠的溶液貌似PH不對(duì)，重新調(diào)整了一次，再做一次，結(jié)果目的蛋白還是沒(méi)有，內(nèi)參較清晰，一抗?jié)舛日{(diào)整到1：200，因?yàn)榭贵w是舊的，現(xiàn)在考慮一抗問(wèn)題，但二抗和內(nèi)參抗體都是同一時(shí)期的。。。。糾結(jié)啊，只剩下10天左右的時(shí)間啦。。。。晚上繼續(xù)奮斗

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8樓2011-08-15 19:54:41

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引用回帖:

7樓: Originally posted by Fire0304 at 2011-08-15 19:49:20:
我也是santa抗體，抗體放久了影響大嗎，因?yàn)槭菐熃闳ツ炅粝碌�，B-actin和二抗也是同時(shí)期的，昨天又做了一次，目的蛋白沒(méi)顯示出條帶，但B-actin較好顯示出。

抗體是凍住的還是放4度的？不管是哪種，用之前最好離下心。避免反復(fù)凍融，最好分裝了放-70度

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9樓2011-08-15 20:01:08

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