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yuyang031985金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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請(qǐng)教Western blot問(wèn)題 已有1人參與
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最近在做Western blot，提取耐藥細(xì)胞的p-gp蛋白，文獻(xiàn)報(bào)道理論分子量170kd，我們跑出來(lái)的分子量130kd左右，而且還不確定是不是該條帶，請(qǐng)高人指點(diǎn)哪里有可能出問(wèn)題？？ 已使用過(guò)的抗體：Abcam的p-gp抗體（兔抗、鼠抗都用過(guò)）；博士德的p-gp抗體 膠的濃度：6%、8%、10%和12%都使用過(guò)； 裂解液：碧云天的強(qiáng)、中強(qiáng)、弱的裂解液都試過(guò)； 提蛋白的方法：總蛋白和膜蛋白的提取都嘗試過(guò)； 使用的膜：0.22微米的PVDF膜 |
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hongyongbo
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2樓2013-08-07 21:08:26
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 改蛋白是否還有其他修飾，我之前也有過(guò)這樣的經(jīng)歷，文獻(xiàn)報(bào)道在120kDa，但是我做出來(lái)始終在56kDa，而且我買(mǎi)的抗體說(shuō)明書(shū)上也是寫(xiě)的56kDa，這些抗體做出來(lái)再120kDa也沒(méi)有條帶，后來(lái)查了文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這個(gè)蛋白存在糖基化，糖基化后分子量會(huì)達(dá)到120kDa，所以你可以查一下你現(xiàn)在這個(gè)蛋白的氨基酸序列，算一下大概有多少Kda，如果說(shuō)氨基酸序列算出來(lái)有170kDa的話，那可能你的實(shí)驗(yàn)確實(shí)存在一定問(wèn)題，考慮換其他公司的抗體，另外建議用0.45uM的PVDF膜，因?yàn)樵摰鞍椎姆肿恿勘容^大。如果氨基酸序列算出來(lái)的分子量在130kDa左右的話可能是該蛋白存在其他修飾。 |
5樓2013-08-07 22:09:32
yuyang031985
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7樓2013-08-08 17:05:42
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8樓2013-08-08 17:07:57
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