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oicqyutong銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】western blot 一直都跑不出來，不知道原因，大俠給分析一下�。�？
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大家好啊，本人系化學(xué)系一名學(xué)生，由于迫不得已，需要做western blot，從一點(diǎn)兒都不懂到現(xiàn)在能做走了很多彎曲的路。但是現(xiàn)在還沒完全弄出來，又分析不出來原因，特來請教各位大蝦們幫忙，小女子在此謝過了…… 我跑的蛋白是24kD的，做的是RNA的沉默�，F(xiàn)在是連對照組都跑不出來。 分析可能原因為 1. 第一步的蛋白裂解沒裂解好。我這次準(zhǔn)備用的是1*10的6次方取3mL種到六孔板中，然后加60微升碧云天RIPA+PMSF裂解液。（之前是用的200微升裂解液裂解6孔板細(xì)胞） 請問這個裂解液上的說明說是幾秒鐘，我直接幾秒就可以還是要裂解1小時呢？ 上樣量我是用的20微升，上16微升加4微升上樣緩沖液。 2. 跑膠問題我覺得應(yīng)該是不大的，但是轉(zhuǎn)膜的時候問題就來了。 轉(zhuǎn)膜時間問題： 轉(zhuǎn)膜的時候我用的是濕轉(zhuǎn)（條件所限，沒有別的方法，大蝦不要挑這個毛�。�。100V轉(zhuǎn)2h，不知道有大俠做過的沒？這個條件可以么？！但是我今天轉(zhuǎn)的時候發(fā)現(xiàn)在用麗春紅染色后，35KD下面的帶顏色很淺，有時候幾乎就是看不見，是轉(zhuǎn)的時間忒長了還是轉(zhuǎn)的時間短了呢？ β-actin是肯定轉(zhuǎn)上了，還有什么轉(zhuǎn)膜時候的問題我就不知道了，請大家根據(jù)我情況給個指導(dǎo)吧！ 3. 封閉我是選擇的5%BSA封閉1h，1抗1h，2抗1h，每個中間每次TBST洗10分鐘*3次。 我的1抗應(yīng)該沒什么問題。 我的2抗是鼎國的山羊抗兔IGg，上面說明是1：5000-1：100000比例稀釋，我稀釋到5000，第一次非特異。后來把用過一次的稀釋到1：8000就沒有非特異了， 但是我要的蛋白也沒出來。后來一次我稀釋到1：8000還非特異，我就很無奈！洗照片的時候在一片黑中好像看到了一丁點(diǎn)兒更黑，希望是我要的，但是這個也不能用啊。 4. 洗照片 我用的方法是ECL顯色，β-actin能看出來有一條很亮的帶，但是，一直都看不到24KD那條帶，不知道怎么回事兒。我現(xiàn)在很無奈，請哪位大俠給講解一下吧。。。萬分感謝��！ 小女子在此再次拜謝啦…… |
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western blotting
★ ★ ★
scelab(金幣+3):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-09-28 22:50:11
oicqyutong(金幣+3):謝謝您的轉(zhuǎn)膜時間的評價，我想問一些具體的！ 2010-10-12 21:40:18
scelab(金幣+3):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-09-28 22:50:11
oicqyutong(金幣+3):謝謝您的轉(zhuǎn)膜時間的評價，我想問一些具體的！ 2010-10-12 21:40:18
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裂解的濃度6孔板60ul差不多了。上樣量也應(yīng)該沒什么問題。這主要看你的一抗是否靈敏，一般這么多也夠了。 裂解（RIPA+PMSF)時間我們一般是冰上30分鐘。 '轉(zhuǎn)膜時間應(yīng)該是太長了，24KD 120V轉(zhuǎn)半個小時差不多了。時間長了會轉(zhuǎn)過的。 |
3樓2010-09-28 21:26:28
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4樓2010-09-28 21:28:09
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5樓2010-10-12 21:39:39
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8樓2012-04-10 20:45:02
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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| 裂解細(xì)胞時間很短就夠了，基本上按照說明書說的就可以了。跑膠的濃度選擇15%就可以了，轉(zhuǎn)膜30min就可以了。一抗你可以試試過夜，這個條件比較好，要么室溫2h，一抗1小時有些短了。其他的什么問題就沒看出來了。 |
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oicqyutong9樓2012-04-11 13:11:13
10樓2012-04-11 13:11:57
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