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oicqyutong銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】western blot 一直都跑不出來，不知道原因，大俠給分析一下�。。�
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大家好啊，本人系化學(xué)系一名學(xué)生，由于迫不得已，需要做western blot，從一點(diǎn)兒都不懂到現(xiàn)在能做走了很多彎曲的路。但是現(xiàn)在還沒完全弄出來，又分析不出來原因，特來請(qǐng)教各位大蝦們幫忙，小女子在此謝過了…… 我跑的蛋白是24kD的，做的是RNA的沉默�，F(xiàn)在是連對(duì)照組都跑不出來。 分析可能原因?yàn)?br /> 1. 第一步的蛋白裂解沒裂解好。我這次準(zhǔn)備用的是1*10的6次方取3mL種到六孔板中，然后加60微升碧云天RIPA+PMSF裂解液。（之前是用的200微升裂解液裂解6孔板細(xì)胞） 請(qǐng)問這個(gè)裂解液上的說明說是幾秒鐘，我直接幾秒就可以還是要裂解1小時(shí)呢？ 上樣量我是用的20微升，上16微升加4微升上樣緩沖液。 2. 跑膠問題我覺得應(yīng)該是不大的，但是轉(zhuǎn)膜的時(shí)候問題就來了。 轉(zhuǎn)膜時(shí)間問題： 轉(zhuǎn)膜的時(shí)候我用的是濕轉(zhuǎn)（條件所限，沒有別的方法，大蝦不要挑這個(gè)毛病）。100V轉(zhuǎn)2h，不知道有大俠做過的沒？這個(gè)條件可以么？！但是我今天轉(zhuǎn)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)在用麗春紅染色后，35KD下面的帶顏色很淺，有時(shí)候幾乎就是看不見，是轉(zhuǎn)的時(shí)間忒長(zhǎng)了還是轉(zhuǎn)的時(shí)間短了呢？ β-actin是肯定轉(zhuǎn)上了，還有什么轉(zhuǎn)膜時(shí)候的問題我就不知道了，請(qǐng)大家根據(jù)我情況給個(gè)指導(dǎo)吧！ 3. 封閉我是選擇的5%BSA封閉1h，1抗1h，2抗1h，每個(gè)中間每次TBST洗10分鐘*3次。 我的1抗應(yīng)該沒什么問題。 我的2抗是鼎國(guó)的山羊抗兔IGg，上面說明是1：5000-1：100000比例稀釋，我稀釋到5000，第一次非特異。后來把用過一次的稀釋到1：8000就沒有非特異了， 但是我要的蛋白也沒出來。后來一次我稀釋到1：8000還非特異，我就很無奈！洗照片的時(shí)候在一片黑中好像看到了一丁點(diǎn)兒更黑，希望是我要的，但是這個(gè)也不能用啊。 4. 洗照片 我用的方法是ECL顯色，β-actin能看出來有一條很亮的帶，但是，一直都看不到24KD那條帶，不知道怎么回事兒。我現(xiàn)在很無奈，請(qǐng)哪位大俠給講解一下吧。。。萬分感謝��！ 小女子在此再次拜謝啦…… |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
| 裂解細(xì)胞時(shí)間很短就夠了，基本上按照說明書說的就可以了。跑膠的濃度選擇15%就可以了，轉(zhuǎn)膜30min就可以了。一抗你可以試試過夜，這個(gè)條件比較好，要么室溫2h，一抗1小時(shí)有些短了。其他的什么問題就沒看出來了。 |
oicqyutong9樓2012-04-11 13:11:13
oicqyutong
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2樓2010-09-28 21:20:47
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western blotting
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scelab(金幣+3):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-09-28 22:50:11
oicqyutong(金幣+3):謝謝您的轉(zhuǎn)膜時(shí)間的評(píng)價(jià)，我想問一些具體的！ 2010-10-12 21:40:18
scelab(金幣+3):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-09-28 22:50:11
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裂解的濃度6孔板60ul差不多了。上樣量也應(yīng)該沒什么問題。這主要看你的一抗是否靈敏，一般這么多也夠了。 裂解（RIPA+PMSF)時(shí)間我們一般是冰上30分鐘。 '轉(zhuǎn)膜時(shí)間應(yīng)該是太長(zhǎng)了，24KD 120V轉(zhuǎn)半個(gè)小時(shí)差不多了。時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)轉(zhuǎn)過的。 |
3樓2010-09-28 21:26:28
zhandeguo1
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