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yuyang031985金蟲 (正式寫手)
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[求助]
請教Western blot問題 已有1人參與
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最近在做Western blot，提取耐藥細胞的p-gp蛋白，文獻報道理論分子量170kd，我們跑出來的分子量130kd左右，而且還不確定是不是該條帶，請高人指點哪里有可能出問題？？ 已使用過的抗體：Abcam的p-gp抗體（兔抗、鼠抗都用過）；博士德的p-gp抗體 膠的濃度：6%、8%、10%和12%都使用過； 裂解液：碧云天的強、中強、弱的裂解液都試過； 提蛋白的方法：總蛋白和膜蛋白的提取都嘗試過； 使用的膜：0.22微米的PVDF膜 |
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biowandy
木蟲 (正式寫手)
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4樓2013-08-07 21:59:09
hongyongbo
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2樓2013-08-07 21:08:26
hongyongbo
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3樓2013-08-07 21:09:04
jiang701820
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 改蛋白是否還有其他修飾，我之前也有過這樣的經(jīng)歷，文獻報道在120kDa，但是我做出來始終在56kDa，而且我買的抗體說明書上也是寫的56kDa，這些抗體做出來再120kDa也沒有條帶，后來查了文獻發(fā)現(xiàn)這個蛋白存在糖基化，糖基化后分子量會達到120kDa，所以你可以查一下你現(xiàn)在這個蛋白的氨基酸序列，算一下大概有多少Kda，如果說氨基酸序列算出來有170kDa的話，那可能你的實驗確實存在一定問題，考慮換其他公司的抗體，另外建議用0.45uM的PVDF膜，因為該蛋白的分子量比較大。如果氨基酸序列算出來的分子量在130kDa左右的話可能是該蛋白存在其他修飾。 |
5樓2013-08-07 22:09:32
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