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章信來木蟲 (正式寫手)
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[求助]
10kd 和100kd的蛋白同時做western blot 已有1人參與
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最近在做基因可變剪切的驗證實驗，預(yù)測目標(biāo)蛋白可變剪切后編碼蛋白只有10多KD，而野生型蛋白則有100kd，用常規(guī)12%的SDS-PAGE做的WB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20KD以下就不存在目的片段（PVDF是0.45的，bio-rad濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時間是100v*1.5h），是我的轉(zhuǎn)膜時間太長了？PVDF膜孔徑太大了？還是要專門的試驗方法？ 有誰做過類似實驗，給個建議！ |
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| 用12%的膠跑是沒有問題的，我以前跑14KD的蛋白都不會轉(zhuǎn)過頭。同時你做WB會有預(yù)染的蛋白MARKER的，最小的分子量應(yīng)該在10-12KD左右，分離膠的時候可以看到是否最小的marker在最前沿，（當(dāng)然要比溴酚藍(lán)慢）然后轉(zhuǎn)膜時間也沒有問題，0.45的可能大了點，試試0.22的吧。再有就是你轉(zhuǎn)膜后，可以先看最小的marker是否在膜上，如果在，就用麗春紅溶液染一下，可以看到你的目的蛋白條帶是否存在，用TBS洗掉，不會耽誤后面的抗體結(jié)合的。 |
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章信來7樓2013-01-30 11:34:04
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