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章信來木蟲 (正式寫手)
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10kd 和100kd的蛋白同時(shí)做western blot 已有1人參與
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最近在做基因可變剪切的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白可變剪切后編碼蛋白只有10多KD，而野生型蛋白則有100kd，用常規(guī)12%的SDS-PAGE做的WB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20KD以下就不存在目的片段（PVDF是0.45的，bio-rad濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間是100v*1.5h），是我的轉(zhuǎn)膜時(shí)間太長了？PVDF膜孔徑太大了？還是要專門的試驗(yàn)方法？ 有誰做過類似實(shí)驗(yàn)，給個(gè)建議！ |
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| 用12%的膠跑是沒有問題的，我以前跑14KD的蛋白都不會(huì)轉(zhuǎn)過頭。同時(shí)你做WB會(huì)有預(yù)染的蛋白MARKER的，最小的分子量應(yīng)該在10-12KD左右，分離膠的時(shí)候可以看到是否最小的marker在最前沿，（當(dāng)然要比溴酚藍(lán)慢）然后轉(zhuǎn)膜時(shí)間也沒有問題，0.45的可能大了點(diǎn)，試試0.22的吧。再有就是你轉(zhuǎn)膜后，可以先看最小的marker是否在膜上，如果在，就用麗春紅溶液染一下，可以看到你的目的蛋白條帶是否存在，用TBS洗掉，不會(huì)耽誤后面的抗體結(jié)合的。 |
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章信來7樓2013-01-30 11:34:04
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