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western-blot 技術(shù)
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| 我現(xiàn)在在做western-blot，現(xiàn)在的圖片發(fā)現(xiàn)整個圖片呈現(xiàn)云霧狀，好像是一抗的濃度大了，我已經(jīng)把濃度降低了，但是發(fā)現(xiàn)還是呈現(xiàn)云霧狀，而且中間沒有相對特別亮的地方。我想問下，在做western的時候還需要注意什么，可以盡量詳細(xì)一點，謝謝哈。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵積極熱心解答問題 2012-09-03 13:45:39
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵積極熱心解答問題 2012-09-03 13:45:39
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轉(zhuǎn)沒轉(zhuǎn)過去，看marker上對應(yīng)的條帶是不是轉(zhuǎn)全了，預(yù)染marker不是都能在膠上看出來么。立春紅染色能說明一定問題，但是檢出限和western不一樣，那個得是蛋白很多的時候，立春紅才能染出來顏色。你用的牛奶的濃度確實低了，可能這也導(dǎo)致了你的封閉不完全，我們實驗室一般用5%~10%的牛奶先室溫封閉一個小時，然后用1%的牛奶一抗孵育，我有時候用實驗室自己做的抗體，背景比較臟，這時候我就用5%的牛奶封閉，背景就很干凈了。牛奶怎么還那么金貴呢，我們一直用惠宜的脫脂奶粉，沃爾瑪專供。。。再者，如果抗體濃度太大了，你洗不干凈，也會造成這種情況，記住我們要的都是特異性結(jié)合，都很結(jié)實，PBST洗兩次肯定是少了，我一般洗五次，血清抗體8次左右。。。。。。。。 |
11樓2012-08-27 18:41:18
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流經(jīng)驗 2012-08-25 20:09:43
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流經(jīng)驗 2012-08-25 20:09:43
| 是黑的都糊成一片么？要么繼續(xù)降低濃度，要么使勁使勁洗洗試試，一抗二抗結(jié)束之后，不是都用PBST洗么。還有就是有時候用5%的牛奶做一抗孵育，能降低背景。第三，就是減少曝光時間，可以壓個幾秒的試試。第四就是你的轉(zhuǎn)膜，是不是真的轉(zhuǎn)過去了特異性的蛋白條帶，第五就是蛋白的load量。western是個很復(fù)雜很欺生的活，一個條件一個條件地摸索吧~祝你好運~ |
3樓2012-08-25 19:31:57
5樓2012-08-25 23:44:43
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7樓2012-08-26 22:13:37
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8樓2012-08-26 22:14:25
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9樓2012-08-26 22:21:52
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