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guaidiandian新蟲 (小有名氣)
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[求助]
Nde1和BamH1雙酶切問題求助 已有5人參與
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| 本人用PRI101AN構(gòu)建過表達(dá)載體，選用的內(nèi)切酶是Nde1和BamH1，Buffer用的是Tango，體系是質(zhì)粒/目的片段22微升，Buffer6微升，內(nèi)切酶各一微升，37度酶切10小時(shí)左右，然后用連接酶連接，但是做了幾次轉(zhuǎn)化都沒有出現(xiàn)菌落，不知啥地方出現(xiàn)在了問題，求助大神~~~~ |
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still2008
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2樓2015-02-01 13:12:50
guaidiandian
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3樓2015-02-01 13:16:39
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4樓2015-02-01 14:01:31
淺語8905
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5樓2015-02-02 12:28:17
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
guaidiandian(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-02-02 21:11:54
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guaidiandian(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-02-02 21:11:54
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本人用PRI101AN構(gòu)建過表達(dá)載體，選用的內(nèi)切酶是Nde1和BamH1， 1, 確定載體里沒有這兩個酶的酶切位點(diǎn) Buffer用的是Tango， 2.確定這個BUFFER是兩個酶通用 體系是質(zhì)粒/目的片段22微升，Buffer6微升， 3. 確定質(zhì)粒和片段總量配比合適，而不是以體積描述 內(nèi)切酶各一微升，37度酶切10小時(shí)左右 4，說明書上要求酶切這么長時(shí)間嗎？？ 5，沒有菌落，說明沒有連上，可能是，酶切沒問題，但是連接酶有問題，也可能是最開始構(gòu)建載體時(shí)載體就有問題 |
6樓2015-02-02 12:58:41
zoe_張
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2015-03-24 09:18:19
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2015-03-24 09:18:19
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1.酶切體系：酶切體系應(yīng)該根據(jù)你質(zhì)粒的濃度來，你22ul的質(zhì)粒是多少ug，還有酶切時(shí)間10小時(shí)，是說明書上說的嗎？你用的BamHI酶是什么牌子的，一般那么長時(shí)間的酶切可能導(dǎo)致星活性，反倒把非特異性位點(diǎn)也給切了 2.酶切以后有回收酶切產(chǎn)物嗎，有電泳看大小是否和你目的片段一致嗎？ 3.連接的體系是怎樣的，載體和目的片段各是多少？ 連接條件是怎樣，一般連接效率不高的時(shí)候可以試下，4度連接過夜 |
7樓2015-03-24 09:02:01
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8樓2016-03-25 11:20:41
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