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我是小李飛刀新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
用過(guò)腸激酶的看過(guò)來(lái)~~~ 已有3人參與
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各位蟲(chóng)友大家好！ 這段時(shí)間我在做原核表達(dá)，用的載體是pET32a，表達(dá)的融合蛋白需要用腸激酶來(lái)切割。網(wǎng)上查酶的購(gòu)買(mǎi)來(lái)源，好多都說(shuō)腸激酶切不開(kāi)。到現(xiàn)在一直沒(méi)找到信價(jià)比可靠的公司（Sigma的用不起�。�。請(qǐng)問(wèn)蟲(chóng)友用的效果比較好的腸激酶是從哪里買(mǎi)的，能否推薦給我？ 謝謝！   |
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2樓2015-03-19 11:21:58
黃宇良
新蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2015-12-15 16:30:49
好吃的甜地瓜
新蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.產(chǎn)品簡(jiǎn)介 雅心重組牛腸激酶是一種高純度的重組牛腸激酶輕鏈片段。該酶經(jīng)HPLC純化，純度高，特異性高，不含其他蛋白酶。腸激酶可以切割含有四個(gè)天冬氨酸的賴(lài)氨酸羧基端肽鍵：天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 賴(lài)氨酸（DDDDK）�？梢栽谳^寬pH范圍（4.5-9.5）和較寬溫度范圍內(nèi)有效切割融合蛋白。腸激酶可去除位于蛋白質(zhì)N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合標(biāo)簽。 2.產(chǎn)品特性 來(lái)源 重組大腸桿菌 外觀(guān) 澄清、無(wú)色至淡黃色液體 活性 ≥ 5.0 U/μl 純度（蛋白電泳） 單一主條帶 電泳（分子量） 25.8 ±2.6kDa單位定義：1U定義為在25℃，12h~16h之內(nèi)，將0.5mg保存于25mM Tris-HCl 8.0 緩沖液中的融合蛋白切割95%所需的酶量。 3.推薦使用方法 1）25℃酶切條件： 按照酶活性定義，酶切條件舉例： 25mM Tris-HCl 8.0體系中： 融合蛋白 0.1-1mg/ml（蛋白總量50-100μg） 重組EK 0.1-0.2U 25℃過(guò)夜酶切，或完全酶切需16-24h，用SDS-PAGE 檢測(cè)酶切效果。 2）4℃低溫酶切條件： 4℃能對(duì)底物進(jìn)行有效酶切，但需要將酶切時(shí)間延長(zhǎng)至48-64h，或增加2-3倍酶量。 3）酶切優(yōu)化和放大 優(yōu)化：可以對(duì)酶切條件進(jìn)行優(yōu)化，例如緩沖液pH，融合蛋白濃度，EK的量，以及酶切時(shí)間，使融合蛋白能在穩(wěn)定條件下被酶切，用SDS-PAGE檢測(cè)酶切效果。 放大：選擇優(yōu)化后的反應(yīng)條件，按該條件等比例放大，用SDS-PAGE檢測(cè)酶切效果。 4）去除重組腸激酶的方法：使用胰蛋白酶抑制劑親和層析（例如sigma T0637）去除重組腸激酶。 5）注意：不建議37℃條件下酶切，可能會(huì)有非特異性酶切出現(xiàn)。 4.常見(jiàn)影響腸激酶活性的因素 在＞200mM 咪唑，或＞200mMNaCl，或＞5%甘油，酶切效果受影響�？蓞⒄找韵峦扑]方法進(jìn)行酶切： 1）為獲得理想酶切結(jié)果，請(qǐng)將樣品透析到25mM Tris-HCl 8.0緩沖液中，再進(jìn)行酶切。 2）若不便透析，可將樣品稀釋?zhuān)溥蚝吭?00mM以下，NaCl濃度在50mM以下，甘油濃度小于5%以下進(jìn)行酶切，酶的用量與蛋白的比例不變（即1U酶切500μg蛋白）。 3）如果樣品溶液中含有上述成分中的一種或多種，且不便去除，此時(shí)適當(dāng)增加酶量或延長(zhǎng)酶切時(shí)間，也可達(dá)到較好酶切效果。 5.儲(chǔ)存和運(yùn)輸穩(wěn)定性 酶液儲(chǔ)存穩(wěn)定性：-20℃，24個(gè)月穩(wěn)定；25℃，一周內(nèi)，無(wú)活性損失。緩沖體系：50mM Tris-HCl，pH8.0，250mM NaCl，2mMCa2+，50%甘油。 酶液反復(fù)凍融穩(wěn)定性：反復(fù)凍融5次，無(wú)活性損失。 運(yùn)輸穩(wěn)定性：藍(lán)冰保溫運(yùn)輸，穩(wěn)定。 6.產(chǎn)品優(yōu)勢(shì) 特異性：特定的蛋白酶，切割前面含有四個(gè)天冬氨酸的賴(lài)氨酸羧基端位點(diǎn)：天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 賴(lài)氨酸 (DDDDK)。 純度高：不含其他蛋白酶，無(wú)非特異性切割。 無(wú)動(dòng)物源性：重組生產(chǎn)，無(wú)外源性的病毒污染，生產(chǎn)過(guò)程不使用任何動(dòng)物源原料。 質(zhì)量穩(wěn)定：批量生產(chǎn)，可保證穩(wěn)定連續(xù)的批次生產(chǎn)；產(chǎn)品批次間無(wú)差異，質(zhì)量穩(wěn)定。 符合法規(guī)要求：生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境符合相關(guān)法規(guī)要求，生產(chǎn)過(guò)程完全遵循NSF ISO 9001:2008質(zhì)量體系并符合GMP指導(dǎo)原則。 質(zhì)量文件完整：按客戶(hù)需求，可提供相關(guān)法規(guī)支持文件。 7.相關(guān)產(chǎn)品 重組羧肽酶B； 序列分析純胰蛋白酶； 重組人胰蛋白酶； 重組抑肽酶。 |
4樓2018-03-07 15:55:14
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
5樓2018-09-30 14:17:09
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