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[求助]
求助細胞內(nèi)總膽固醇/游離膽固醇提取方法（LC-MS）用 已有1人參與
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 最近打算測定巨噬細胞內(nèi)的膽固醇，由于細胞量較少，因此考慮用LC-APCI-MS進行測定，但是在提取膽固醇時遇到了較大的問題，請諸位高手指教。我考察的提取方法： 1，細胞生理鹽水洗兩遍，1ml生理鹽水中刮下，超聲裂解破碎。 2-1，對于總膽固醇，160ul裂解液中加入300ul的15%KOH（乙醇溶液），震蕩至澄清。 2-2，對于游離膽固醇，160ul裂解液中加入300ul的 8.9mM KOH（乙醇溶液），80℃水浴1h。 3，二者皆加入等體積的異丙醇：正己烷（v/v 1:4），震蕩30s進行進行萃取，萃取產(chǎn)物800g離心5min，取上清入新管 4，使用異丙醇：正己烷（v/v 1:4）重復萃取共三次，合并上清液，真空減壓干燥 存在問題： 主要問題存在于總膽固醇的提取步驟，第一次加入萃取溶劑460ul后，震蕩分層共三層，上清液不足300ul，中層渾濁，最下層澄清不足100ul。 再次加入300ul萃取溶劑，震蕩分層所得上清不足200ul，最下層量增加，中間層仍渾濁。 再次加入500ul萃取溶劑，只有兩層，最下層澄清，以及上層整體渾濁。 另外，游離膽固醇的提取若按照上述方法，所得上清也會越來越少 想請教： 1、最上層是否是純正己烷，膽固醇是否溶于其中？中層的渾濁是KOH的鹽沉淀，還是蛋白。大量的KOH溶解在哪？ 2、我的操作是否有明顯問題，大家有沒有成熟的方法可以分享，最好能附參考文獻，感激不盡！ |
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