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AyMing新蟲 (初入文壇)
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BugBuster細(xì)胞破碎液的使用方法 已有1人參與
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| Novagen公司的試劑盒去哪找說(shuō)明書？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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· BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 BugBuster Master Mix（貨號(hào)71456）是將BugBuster蛋白抽提試劑，Benzonase核酸酶和rLysozyme™溶菌酶溶液按最優(yōu)化配比混合好的一種非常方便使用的蛋白抽提試劑，有助于在最優(yōu)化條件下獲得可溶活性蛋白。這種預(yù)混形式的試劑減少了稀釋試劑、計(jì)算各種試劑使用量和分別添加的麻煩。100 mL和500 mL包裝分別足夠用于20 g和100 g細(xì)胞沉淀的可溶蛋白抽提。 可溶蛋白制備 采用此操作抽提到的蛋白包括來(lái)自細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的可溶蛋白。如果欲僅收集周質(zhì)部分蛋白，可以參考Novagen的TB055“PET系統(tǒng)操作手冊(cè)”中提到的滲壓休克方法或其它合適的方法。滲透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以獲得細(xì)胞質(zhì)中的可溶蛋白。 1.用經(jīng)預(yù)先稱重的離心管10,000g離心10分鐘從液體培養(yǎng)體系收集細(xì)胞。如果是小規(guī)模培養(yǎng)（如1.5 mL或更少），可以用1.5 mL離心管14,000–16,000g離心。盡量?jī)A去液體，稱量細(xì)胞沉淀濕重。 2.室溫下用吸打或溫和渦旋使BugBuster Master Mix與細(xì)胞沉淀混勻，每克細(xì)胞糊需要5 mL抽提試劑。這相當(dāng)于50 mL培養(yǎng)液采用2.5 mL抽提試劑。如果是小規(guī)模培養(yǎng)，則采用約1/5培養(yǎng)體積的抽提試劑重懸沉淀（例如，1.5 mL培養(yǎng)液采用300 μL抽提試劑）。如果抽提試劑過(guò)量也沒(méi)有什么副作用。 選做：加蛋白酶抑制劑。BugBuster Master Mix與蛋白酶抑制劑兼容。如果目的蛋白后續(xù)要用凝血酶（貨號(hào) 69671），Xa因子（貨號(hào)69036）或重組腸激酶（貨號(hào)69066）處理，就應(yīng)該避免使用絲氨酸蛋白酶抑制劑。除盡純化過(guò)程可能去除活性抑制劑，建議在酶切前最好做透析或凝膠過(guò)濾。 3.室溫下將重懸的細(xì)胞液在搖板或低速攪拌器上孵育10-20分鐘。 注意：孵育后獲得的抽提物不是粘稠的。 4.4℃下16,000g離心20分鐘以去除不溶的細(xì)胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵體純化”（見(jiàn)以下說(shuō)明）的材料。 5.將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新試管。這樣抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上樣于Novagen的純化樹脂（以及其它很多類似純化系統(tǒng)）。蛋白溶液在冰上可以短時(shí)存放（2-3小時(shí)），也可在-20℃長(zhǎng)時(shí)間存放直至下步分析。蛋白抽提液應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的活性要求的溫度存放，有些蛋白經(jīng)凍融會(huì)失活。 高純度包涵體的制備 以下操作可用于任何 BugBuster®系列產(chǎn)品抽提的包涵體純化。 1.如可溶蛋白抽提步驟1-4進(jìn)行操作。 2.將步驟“4”所得到的沉淀重懸于BugBuster（貨號(hào)70584），BugBuster的量與當(dāng)初重懸細(xì)胞糊的體積相同。吸打并渦旋以獲得均勻的懸浮液。充分重懸沉淀能夠溶解、去除雜蛋白以獲得高純度的包涵體。 3.加入rLysozyme™溶液至終濃度為1KU/mL。溫和渦旋混勻，室溫孵育5分鐘。 注意：如果采用的是BugBuster Master Mix就不需要另加rLysozyme了（即可省去此步操作）。 4.加入6倍體積的經(jīng)1:10去離子水稀釋的BugBuster重懸，渦旋1分鐘混勻。 5.于4℃，5,000g離心15分鐘，以吸管移去上清，收集包涵體。 6.將包涵體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)體系體積一半的經(jīng)1:10稀釋的BugBuster中，渦旋混勻，如步驟5離心。此步驟重復(fù)兩次。再次重懸，于4℃，16,000g離心15分鐘并去除上清。 7.重懸最終的沉淀（即純化的包涵體）于選定的緩沖液，最好是能與后續(xù)純化方法兼容的緩沖液。包涵體可以重懸于Novagen的蛋白重折疊試劑盒（貨號(hào)70123）中的1×溶解緩沖液（參考操作手冊(cè)TB234）或其它變性劑。不溶的His•Tag®融合蛋白可以用含有變性劑的1×結(jié)合緩沖液重懸用于His•Bind®純化（IDA或NTA）。 |
2樓2019-03-08 20:48:07
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