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busen鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
怎么使線性腺病毒基因組環(huán)化？如果采用同源重組的方法，右側(cè)同源臂只有200bp夠么？
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要構(gòu)建一個新的腺病毒載體,可是基因組是線性的，怎么將大腸桿菌的復(fù)制原點和抗性基因加入基因組中去，并實現(xiàn)基因組的環(huán)化呢？ 我看到的文獻大概有三種方法  ①先通過酶切加上復(fù)制原點和抗性基因，然后導(dǎo)入鼠嬰腎細(xì)胞，實現(xiàn)自發(fā)環(huán)化，這種環(huán)化質(zhì)粒好獲得嗎？ ②將第一種方法的酶切步驟替換為同源重組，也就是說用同源重組的方法，將復(fù)制原點和抗性基因重組到腺病毒基因組中去，同時實現(xiàn)某些非必須基因的刪除，然后再導(dǎo)入鼠嬰腎細(xì)胞，實現(xiàn)環(huán)化。用這種方法的話，同源重組后的腺病毒怎么篩選？ ③從腺病毒兩端各取一部分作為同源臂，同源臂之間裝載復(fù)制原點和抗性基因，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒。將穿梭質(zhì)粒線性化以后，和腺病毒基因組同時導(dǎo)入BJ5183細(xì)菌中，通過同源重組的方法直接環(huán)化。 我們現(xiàn)在正在試圖采用第三種方法，不過文獻中設(shè)計的左側(cè)同源臂有2800bp，而右側(cè)同源臂只有200bp，是不是有點短？感覺不是很靠譜啊？？  另外，從PET載體上擴增下來的pBR322+kana R基因能直接轉(zhuǎn)T載體嗎？一個質(zhì)�？梢杂袃蓚�大腸桿菌復(fù)制原點嗎？  內(nèi)容有點多，希望知道的同僚給予幫助，只回答一部分問題也萬分感激�。。�！  |
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