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風(fēng)隨心動(dòng)銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
Red重組不成功，希望各位大俠幫幫忙，指點(diǎn)下小弟。 已有2人參與
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目的：將pKD46的AMP換成博來(lái)霉素抗性。菌株：DH5α 1.線性打靶盒子的構(gòu)建 同源臂長(zhǎng)度為35bp，膠回收產(chǎn)物濃度應(yīng)該夠。 2.電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備 用試管搖菌過(guò)夜，第二天以1%的接種量至含有Amp的40mlLB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1小時(shí)后，加入0.3%的L-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)2小時(shí)。冰浴冷卻。用10%甘油洗兩次，最終濃縮至200ul以10%甘油重懸。 3.電擊轉(zhuǎn)化 將2mm電轉(zhuǎn)杯從70%乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。預(yù)冷。 取100ul最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5ul線性打靶盒子，用槍輕輕吸打混勻（因?yàn)榛靹蛄烁杏X(jué)效率會(huì)高一點(diǎn)）。冰浴2分鐘。 電轉(zhuǎn)參數(shù) 2500V 200歐 25μF 電擊后顯示，電擊時(shí)間為4.8ms。 4.復(fù)蘇與涂布 加入1ml的LB，30℃，200rpm，1小時(shí)。然后涂布在博來(lái)霉素平板。涂干。 30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。 結(jié)果：平板上一個(gè)菌都木有，好崩潰，各位高手幫幫忙，先謝過(guò)了。 |
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