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梵天傲金蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
關(guān)于平端連接
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最近在做平端連接，但是一直連不上，想要分析原因，于是做了一個(gè)最簡(jiǎn)單的對(duì)照試驗(yàn)，酶切質(zhì)粒后補(bǔ)平直接進(jìn)行自連。想要確定自己的試驗(yàn)體系或操作是否有問(wèn)題�？墒蔷尤粚�(duì)照試驗(yàn)也沒(méi)有成功，請(qǐng)做過(guò)平端連接蟲(chóng)友們幫忙分析一下原因。 對(duì)照試驗(yàn)的思路為： Hind III和EcoR I酶切質(zhì)粒pMD18-T，膠回收，T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，然后T4 DNA連接酶連接，最后取全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。 具體操作步驟： （內(nèi)切酶、聚合酶、連接酶均購(gòu)自寶生物） 1) Hind III與EcoR I酶切質(zhì)粒pMD18-T，膠回收，DNA濃度儀測(cè)得回收片段濃 度為0.03μg\μl。 2)T4 DNA聚合酶補(bǔ)平：DNA片段：6μl 聚合酶buffer：1μl 0.1% BSA：1μl dNTP：1μl 配置好后在70℃水浴5min，移入37℃溫箱放置10min。 加入1μl的聚合酶，用移液槍輕輕混合，37℃溫箱放置5min。 漩渦2000轉(zhuǎn)使酶失活，70℃水浴10min 3)T4 DNA 連接酶連接 DNA 片段(補(bǔ)平的10μl體系不做任何處理)：10μl 連接酶buffer： 2.5μl 連接酶： 2μl ddH2O： 10.5μl 22℃反應(yīng)22h 4)取連接體系25μl樣直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。 不必針對(duì)我的這個(gè)對(duì)照試驗(yàn)，蟲(chóng)友們有好的關(guān)于平端連接的經(jīng)驗(yàn)也說(shuō)下哈！ [ Last edited by 350784478 on 2009-7-16 at 21:01 ] |
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