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lvbobo823鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
GUS染色問題 已有2人參與
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各位蟲友們： 最近做小麥花穗的GUS瞬時表達(dá)，發(fā)現(xiàn)各組織都被染上。 具體做法是取小麥幼穗分別剝?nèi)』ㄋ�，花粉，�?nèi)稃，萼片等在高滲培養(yǎng)基上處理4小時后進(jìn)行基因槍轟擊，先轟擊只含金粉的對照，再分別轟擊含有目的片段的質(zhì)粒。兩天后進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)不管對照還是含有目的載體的雌蕊都染成藍(lán)色，其他組織部分染上色。我用的啟動子是雌蕊特異表達(dá)的。 GUS染液成分（50 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4, 0.4 mM K3[Fe(CN6)], 0.4 mM K4[Fe(CN6)], 8 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 20% 甲醇, 1mg/ml X-gluc）樣品37度過夜孵育，70%酒精脫色2-3次后觀察。 希望各蟲友幫忙解決一下染色不特異情況，另外問一下小麥GUS染色有沒有別的特殊要求？應(yīng)該怎樣做，望各位大神不吝指教，不勝感激。 注：GUS基因?qū)Ρ仁歉鷓GWB3一致。再一個我發(fā)現(xiàn)只要材料有損傷的地方容易被染上色。 謝謝各位蟲友幫忙！這問題困擾我老長時間了。 |
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檢測過不轟擊的嗎?另外能找到陽性對照嗎? 最簡單的是換GUS染色方法, 以下是我用過的，很好用，陰性對照沒出現(xiàn)過。 轉(zhuǎn)基因煙草葉片剪碎，經(jīng)90％丙酮冰浴30 min，室溫下1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)（配方后附）洗兩次，每次15 min，之后加入GUS組織化學(xué)染色反應(yīng)液（配方后附），37℃避光溫育24 h。倒掉反應(yīng)液，70％乙醇4℃固定幾小時，95%乙醇脫色，照相。 1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)(1000 mL)： NaH2PO4 38.9 g Na2HPO4 258.12 g 調(diào)pH值到7.2，ddH2O定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。 0.2 mol/L NaH2PO4 (pH7.0) (100 mL)： 3.12 g NaH2PO4•2H2O溶于滅菌ddH2O中，定容至100 mL 0.2 mol/L Na2HPO4 (pH7.0) (100 mL)： 7.17 g NaH2PO4•12H2O溶于滅菌ddH2O中，定容至100 mL GUS組織化學(xué)染色反應(yīng)液(20 mL)： 0.2 mol/L NaH2PO4 (pH7.0) 5mL 0.2 mol/L Na2HPO4 (pH7.0) 5mL EDTA (0.5 mol/L ，pH8.0) 5mL Tween-20 80μL K3[Fe(CN)6] (170 mmol/L) 118μL K4[Fe(CN)6] (170 mmol/L) 118μL X-Gluc (20mg/mL) 1mL 加ddH2O定容至20 mL，分裝后-20℃貯存。 |
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