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zhuwenjuan1新蟲 (初入文壇)
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[求助]
噬菌斑測量病毒滴度 已有1人參與
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有哪位高手做過噬菌斑測量病毒滴度實驗的，我沒做過這個遇到幾個問題，想請高手幫我指點指點。 用噬菌斑法測定病毒滴度。實驗步驟如下： 1.無菌條件下，2 mL/孔細(xì)胞（5×105 cells/mL）種入6孔板，室溫孵育1 h使其貼壁，孵育后鏡檢其貼壁程度。 2.將4% agarose gel放入70℃水浴鍋融解，空100 mL無菌瓶與2×Grace放入40℃水浴鍋預(yù)熱。 3.將桿狀病毒用無血清supplemented Grace梯度稀釋：10-1~10-8， 4.棄6孔板內(nèi)上清，快速加入稀釋好的病毒，1mL/孔，復(fù)孔，室溫孵育1 h。 5.配置上層瓊脂：加20 mL高溫滅活FBS到2×Grace 100 mL，25 mL 2×Grace（含F(xiàn)BS）+12.5 mL 無菌水+12.5 mL 4% agarose geL，至預(yù)熱的100 mL無菌瓶，輕輕混勻，放入37℃水浴鍋備用。 6.棄6孔板內(nèi)上清，快速加2 mL上層瓊脂，以防菌層干燥，靜置10-20 min使其凝固。將6孔板放入27℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4天。 7.配制1 mg/mL中性紅溶液，在Grace完全培養(yǎng)基中，無菌過濾。 8. 1.5 mL的上述溶液，16.5 mL Grace完全培養(yǎng)基，6 mL 4%的瓊脂配制成中性紅上層瓊脂。 9.在病毒感染4天后，加1 mL中性紅上層瓊脂。 10.繼續(xù)放到培養(yǎng)箱中，4~5天后即可觀察噬菌斑，計數(shù)噬菌斑的數(shù)量，求得病毒滴度。 在實驗過程中，在第6步時，瓊脂一直處于半凝固狀態(tài)，等到培養(yǎng)4天加中性紅的時候，會和第一次的瓊脂混合，達(dá)不到分層的效果，這是為什么？我們用的瓊脂是高熔點的，在35℃以上才會溶解，室溫在27℃左右。希望有做過的蟲友幫忙解答一下，不勝感激！ |
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- 噬菌體效價測定不出來，稀釋100倍后平板上全是噬菌斑，稀釋1000倍缺沒有噬菌斑~~
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stephenreal
至尊木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 病毒、病毒感染與宿主免疫
2樓2015-12-01 08:31:48
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