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林然澤新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白預(yù)處理
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本人最近正在進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于蛋白質(zhì)的預(yù)處理很是頭疼，個(gè)人總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)中心的預(yù)處理方案，希望各路大神給予指導(dǎo)。 1.取動(dòng)物組織0.1g,加裂解液1ml，粗磨，再加入適量液氮研磨。 2取研磨液冰上混旋45分鐘，15000轉(zhuǎn)，4℃離心45分鐘。收取上清，上清為蛋白，棄沉淀。（若不是馬上做酶解，可以將蛋白樣品分裝，于－80℃保存?zhèn)溆茫焕鋬鰰r(shí)間盡量短，不超過(guò)2周）。 3.加入DTT到蛋白混合物溶液中，保證其終濃度為10 mM， 37℃酶解儀反應(yīng)60 min后，再加入IAA，保證其終濃度為55 mM，避光，室溫反應(yīng)45 min后 4.加入5倍體積的冰丙酮，沉淀大于等于5小時(shí)后，4 ℃離心14000 g×10 min，再將蛋白沉淀重溶于25 mM的ABC溶液中，加入特異性內(nèi)切蛋白酶trypsin，保證酶：蛋白為1:50（w/w），37℃酶解儀中酶解過(guò)夜 ，真空凍干酶解產(chǎn)物。 |
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