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王小燕30

銅蟲 (小有名氣)

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30樓: Originally posted by calorimetry at 2015-06-18 16:58:22
樓主的PCR明顯的出現(xiàn)了涂帶，我大概知道原因。

我把你的問(wèn)題發(fā)給我美國(guó)的師姐（她就是本版的顧問(wèn) 凌波麗），我明天上午大概能夠得到她的回復(fù)（美國(guó)跟這里有數(shù)小時(shí)的時(shí)差），看她是否同意我的見解，明天或者回復(fù) ...

先謝謝你這么費(fèi)心了，，，太感謝大家了。。我做了很久實(shí)驗(yàn)一直這樣拖尾😌，都不知道怎么辦了。提模板DNA效果也不好

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31樓2015-06-18 20:51:58

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calorimetry

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:46:35

我?guī)熃?凌波麗回復(fù)的。

長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對(duì)策（包括PCR原因和電泳原因）

凌波麗

長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因：
一、PCR反應(yīng)的原因：
酶量過(guò)多，DNA模板量過(guò)大，dNTP濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多。DNA模板不純，PCR操作時(shí)有外源的DNA污染。
大于3kb的DNA一般用Long-Range PCR。Long-Range PCR的酶的保真性一般比較好，酶的保真問(wèn)題一般不會(huì)引起地毯帶或者涂帶。
二、電泳檢測(cè)出的問(wèn)題。
三、長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的不太可能的原因是：
1.引物的專一性差一般會(huì)有異常擴(kuò)增帶，但是一般不會(huì)出現(xiàn)涂帶和地毯帶。
2.引物二聚體形成一般也只會(huì)出現(xiàn)異常擴(kuò)增帶，通常分子量很小，也不會(huì)出現(xiàn)一般不會(huì)出現(xiàn)涂帶和地毯帶。
3.Long-Range PCR的酶的保真性一般比較好，酶的保真性問(wèn)題一般不會(huì)引起地毯帶或者涂帶。

針對(duì)各種原因的相應(yīng)的對(duì)策有：
1.減少酶量分梯度上下調(diào)一調(diào)，可以參考說(shuō)明書。
2. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時(shí)間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計(jì)引物之前，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。具體調(diào)節(jié)可以參考說(shuō)明書。
3.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。具體調(diào)節(jié)可以參考說(shuō)明書。
4.可以改用巢式PCR。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購(gòu)買。
5. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測(cè)一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。還要注意模板DNA是否發(fā)生了降解。
6.操作時(shí)要防止外源DNA污染，尤其是用微量移液器時(shí)，要在消毒棉塞在“槍頭”與微量移液器的吸管之間，或者購(gòu)置專門的有在兩者之間有隔膜的專用微量移液器。
7.適當(dāng)減少DNA模板量，可以梯度減少。
8.適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，一般也就循環(huán)25次就差不多了。

9.電泳檢測(cè)的原因：
還有一個(gè)原因，我過(guò)去一直沒有考慮到，因?yàn)樵?014年暑假里，凌波麗重新實(shí)際學(xué)習(xí)和操作了DNA分離提純（抽提和電泳），基因克隆和定量PCR等基本的分子生物學(xué)操作后想到的。
PCR本身么有問(wèn)題，問(wèn)題出在DNA電泳操作這一步。
DNA電泳拖尾
電壓過(guò)大，根據(jù)電泳槽設(shè)置合適的電壓；
緩沖溶液離子濃度過(guò)高，調(diào)整鹽濃度在0.1mol/L以下；
DNA上樣量過(guò)多，稀釋DNA樣品濃度或者減少上樣量；
DNA發(fā)生了降解，重新提取DNA，并且加入DNase的抑制劑或者足夠量的蛋白質(zhì)的變性劑或者蛋白酶K。
電泳用的瓊脂糖凝膠濃度與DNA的分子量不匹配，濃度度過(guò)小導(dǎo)致大小的DNA都穿透了凝膠。

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32樓2015-06-19 10:42:44

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calorimetry

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我的美國(guó)師姐回答的已經(jīng)夠全面，無(wú)論是PCR本身，還是DNA電泳，她還是說(shuō)準(zhǔn)備再查一下文獻(xiàn)在繼續(xù)討論。她7月就回國(guó)度假了，到時(shí)你可以直接與她討論。

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33樓2015-06-19 10:45:37

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不要以討論P(yáng)CR，就說(shuō)是酶有問(wèn)題，引物專一性不夠。

引物專一性不夠，但是引物都是化學(xué)合成的，總不會(huì)是N種引物混合到一起當(dāng)作一次反應(yīng)的PCR反應(yīng)的一對(duì)引物去做吧。既然不是如此，怎么可能會(huì)有涂帶和地毯帶哪？有涂帶和地毯帶的出現(xiàn)如果真的是如果是引物問(wèn)題，那么必須是N種引物在同一次PCR起作用。

這貼是我寫的，上面署名凌波麗的帖子是我在美國(guó)的師姐寫的，兩個(gè)討論帖都是第一次發(fā)布。

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34樓2015-06-19 10:52:07

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引用回帖:

33樓: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:45:37
我的美國(guó)師姐回答的已經(jīng)夠全面，無(wú)論是PCR本身，還是DNA電泳，她還是說(shuō)準(zhǔn)備再查一下文獻(xiàn)在繼續(xù)討論。她7月就回國(guó)度假了，到時(shí)你可以直接與她討論。

有個(gè)大神師姐帶真好

可憐我實(shí)驗(yàn)室每一個(gè)人會(huì)的

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35樓2015-06-19 10:52:58

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我的師姐的郵箱（被我公布在小木蟲的那個(gè)）近日被人黑掉了，看來(lái)小木蟲里也有少數(shù)心術(shù)不正的人。

我?guī)熃阌秒娮余]件告訴我：她寫的PCR系列的凌波麗個(gè)人總結(jié)草稿現(xiàn)在已經(jīng)堆到了35000字，她說(shuō)完成的話，字?jǐn)?shù)至少要乘以3。

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36樓2015-06-19 10:57:31

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35樓: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-19 10:52:58
有個(gè)大神師姐帶真好

可憐我實(shí)驗(yàn)室每一個(gè)人會(huì)的...

發(fā)上來(lái)，大家共同討論嘛。我的美國(guó)師姐下月初就回國(guó)過(guò)暑假了。到時(shí)你也可以與她討論。

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37樓2015-06-19 10:59:34

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32樓: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:42:44
我?guī)熃?凌波麗回復(fù)的。

長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對(duì)策（包括PCR原因和電泳原因）

凌波麗

長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因：
一、PCR反應(yīng)的原因：
...

師姐果然厲害！

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38樓2015-06-19 11:26:56

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恩，回頭我怎么聯(lián)系上她哦？而且她忙不，我這樣打擾方便不？非常感謝了😁

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39樓2015-06-19 11:28:35

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39樓: Originally posted by 王小燕30 at 2015-06-19 11:28:35
恩，回頭我怎么聯(lián)系上她哦？而且她忙不，我這樣打擾方便不？非常感謝了😁
...

我的美國(guó)師姐是生物綜合版和分子生物版的顧問(wèn)：凌波麗，她回國(guó)時(shí)會(huì)上小木蟲，你也可以用站內(nèi)郵件聯(lián)系她。

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40樓2015-06-19 11:34:43

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